趙 梅，張紹鈴，齊開(kāi)杰，衡躍進(jìn)，陶書(shū)田，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095；2.寶應(yīng)縣奕佳農(nóng)牧有限公司，江蘇寶應(yīng)225800）

植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等多種生理功能[1]。植物多酚在糧食、蔬菜中含量較少，但在水果及谷物皮層中含量較高[2]。梨是我國(guó)第三大水果，面積和產(chǎn)量?jī)H次于蘋(píng)果和柑橘。由于其含有多種如熊果苷、綠原酸、香草醛等多酚類物質(zhì)[3-4]，因此具有一定的抗氧化保健功能。研究表明，雖然在成熟梨果實(shí)中這些多酚物質(zhì)存在的相對(duì)濃度不是很高，但梨幼果卻含有十分豐富的多酚類物質(zhì)[3-5]。在生產(chǎn)中，由于生理落果或疏花疏果等栽培管理的需要，大量梨幼果被遺棄，在一定程度上造成了多酚類生物資源的浪費(fèi)，而如何回收利用這些生物資源的關(guān)鍵在于如何高效地提取這些多酚類物質(zhì)，但關(guān)于梨幼果中多酚類物質(zhì)高效提取方法的研究還鮮有報(bào)道。本研究主要以梨幼果為材料，對(duì)多酚物質(zhì)的提取方法進(jìn)行了研究，以期優(yōu)化梨幼果多酚提取工藝，并利用高效液相色譜法對(duì)其酚類物質(zhì)組成進(jìn)行研究，為梨果實(shí)酚類物質(zhì)提取和應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘翠冠’幼果（落花后一個(gè)月） 采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦梨資源圃；標(biāo)樣熊果苷、沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、香草醛、阿魏酸、蘆丁、根皮苷、槲皮素 購(gòu)自Sigma公司，均為色譜純；其他試劑 分析純。

FA2104電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；THZ-C恒溫?fù)u床 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；UV-1800可見(jiàn)紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀 美國(guó)沃特斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

挑選健康的幼果，去皮去核，果肉切成小塊，液氮研磨成粉末，稱取一定質(zhì)量的粉末，按一定的提取條件在恒溫?fù)u床中勻速浸提，將粗提液離心過(guò)濾后，測(cè)定并計(jì)算多酚得率。

1.2.1 梨幼果多酚含量的測(cè)定 采用福林酚法（Folin-Ciocalteu）[6]測(cè)定，以沒(méi)食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算梨幼果多酚含量?；貧w方程為y=8.5095x+0.0111，R2=0.9984。

1.2.2 梨幼果多酚得率的計(jì)算 多酚得率（mg/g）=C×V×N/m，式中：C為提取液中多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；m為梨幼果果肉質(zhì)量（g）。

1.2.3 梨幼果多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn) 選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比為影響因素，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響 采用不同的乙醇濃度10%、30%、50%、70%、90%，固定提取時(shí)間2.5h，提取溫度60℃，提取料液比1∶20（g/mL），研究不同乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。

1.2.3.2 提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響 采用不同的提取時(shí)間2、4、6、8、10、12h，固定乙醇濃度50%，提取溫度60℃，提取料液比1∶15（g/mL），研究不同提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響 采用不同提取溫度20、40、60、80、100℃，固定乙醇濃度50%，提取時(shí)間1.5h，料液比1∶20（g/mL），研究不同提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。

1.2.3.4 料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響 采用不同提取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定乙醇濃度50%，提取時(shí)間2.5h，提取溫度60℃，研究不同提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。

1.2.4 梨幼果多酚提取的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)。其具體實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal array design

1.2.5 梨幼果酚類物質(zhì)HPLC分析 提取物經(jīng)過(guò)0.45μm微濾膜過(guò)濾后，利用色譜儀進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜分析條件[4]：色譜柱，C18柱150mm×4.6mm，Φ5μm；流動(dòng)相，甲醇和水；柱溫，30℃；流速，0.6mL·min-1；進(jìn)樣量，5μL；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)280nm。流動(dòng)相A：水，用磷酸調(diào)pH3.2；流動(dòng)相B：甲醇。線性梯度淋洗程序，時(shí)間（min）/B（%）：0/2、3/2、4/25、11/50、16/80、26/80、30/2、35/2。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響 由圖1可以看出，乙醇濃度低于70%時(shí)，隨著乙醇濃度增加，梨幼果多酚得率也逐漸提高；乙醇濃度高于70%時(shí)，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而下降。乙醇濃度過(guò)低，多酚得率低，可能是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，而水?dāng)嗔褮滏I的作用較弱，提取液中水的比例過(guò)高時(shí)，不足以破壞樣品中多酚類物質(zhì)與蛋白、多糖或其他物質(zhì)的連接，多酚得率低[7]；乙醇濃度過(guò)高，多酚得率低，可能是因?yàn)槿艹鲚^多醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性較強(qiáng)的成分，這些成分與多酚類化合物競(jìng)爭(zhēng)同一乙醇水分子[8]。乙醇濃度為50%和70%時(shí)，多酚得率之間沒(méi)有顯著性差異，考慮到工業(yè)成本，確定最佳乙醇濃度為50%。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響 如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4h，多酚得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多酚得率開(kāi)始下降。這是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，可以使多酚充分溶解于溶劑中，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)因?yàn)闇囟鹊挠绊懓l(fā)生降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)[9]。此外，時(shí)間越長(zhǎng)，耗能越大[10]，故選擇最佳提取時(shí)間為4h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols

2.1.3 提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響 由圖3可知，在所設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)，多酚得率隨溫度的升高而呈增大趨勢(shì)。在20～40℃之間，多酚得率上升速率最慢，40～60℃之間，多酚得率的升高最明顯，60～100℃之間，多酚得率的增量有所下降?？赡苁怯捎陔S著溫度的升高，一方面有利于未游離出來(lái)的多酚的浸出[11-12]，另一方面，也促進(jìn)已經(jīng)提取出來(lái)的多酚的氧化與降解[13]。故綜合考慮選擇最佳提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols

2.1.5 料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響 由圖4可以看出，隨著料液比的增大，多酚得率逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25以后，料液比繼續(xù)增大，多酚得率增加緩慢。這可能是由于料液比為1∶25時(shí)，溶劑已經(jīng)能將梨幼果中多酚提取出來(lái)，繼續(xù)增加料液比，并不能顯著提高多酚得率。而且料液比過(guò)高，不利于回收，且造成浪費(fèi)。因此，從提取效果、經(jīng)濟(jì)角度方面考慮，料液比選擇1∶25較為合適。

圖4 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polyphenols

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化梨幼果多酚提取條件

通過(guò)各因素的極差R（見(jiàn)表2）比較發(fā)現(xiàn)RB＞RA＞RD＞RC，極差R越大，其對(duì)應(yīng)因素對(duì)梨幼果多酚得率影響越大。因此，本實(shí)驗(yàn)影響因子的先后順序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋咎崛×弦罕龋咎崛r(shí)間。將極差最小的因素（提取時(shí)間）作為誤差項(xiàng)，方差分析（見(jiàn)表3）進(jìn)一步表明，提取溫度和乙醇濃度是影響幼果多酚得率的主要因素。梨幼果多酚提取最佳提取組合為A3B3C1D3，即乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，提取料液比1∶30（g/mL），依照此組合進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，多酚得率可達(dá)到1.47mg/g。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of orthogonal array design

表3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results of orthogonal array design

2.3 梨幼果多酚物質(zhì)HPLC分析結(jié)果

利用高效液相色譜法可以較好地分離各種酚類成分，標(biāo)樣中11種組分的出峰順序依次為熊果苷、沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、香草醛、阿魏酸、蘆丁、根皮苷、槲皮素（見(jiàn)圖5（A））。梨幼果樣品中測(cè)定出9種酚類物質(zhì)（見(jiàn)圖5（B）），未檢測(cè)到根皮苷和槲皮素。檢測(cè)出的酚類物質(zhì)中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%；兒茶素、綠原酸、香草醛含量較高，為主要的酚類物質(zhì)；沒(méi)食子酸含量最低。

3 結(jié)論

本文對(duì)梨幼果多酚提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用高效液相色譜分析其組分，為梨果實(shí)酚類物質(zhì)代謝研究和生物資源的利用提供了可靠的理論依據(jù)和技術(shù)方法。正交實(shí)驗(yàn)和方差分析結(jié)果表明提取溫度、乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響是顯著的，最佳提取工藝組合：乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，提取料液比1∶30（g/mL），依照此水平進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，多酚得率可達(dá)到1.47mg/g。通過(guò)高效液相色譜分析可知，梨幼果主要含有熊果苷、兒茶素、綠原酸、香草醛等多酚物質(zhì)，其中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%。熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，抑制皮膚黑色素的形成，是目前國(guó)內(nèi)外美白化妝品中的主要原料[14]。因此，梨幼果可作為化妝品美白劑熊果苷的天然原料，是潛在的生物資源。

圖5 多酚組分的高效液相色譜出峰圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of phenolic components

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