泉州師范學院化學與生命科學學院 洪偉超 李裕紅 徐旸旸

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鉛脅迫對鳳眼蓮氮代謝關鍵酶的影響

泉州師范學院化學與生命科學學院 洪偉超 李裕紅*徐旸旸

該文研究了系列濃度Pb2+脅迫6h、6d、20d、60d對鳳眼蓮氮代謝關鍵酶活性的影響。結(jié)果表明：無論有無Pb2+污染存在，鳳眼蓮的根、葉的GS活性大于NADH-GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表現(xiàn)為葉＞根。6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫均使根和葉的GS活性降低，但在Pb2+脅迫60 d后，隨著鳳眼蓮新生組織的萌生，各處理濃度組的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升，鳳眼蓮葉片的GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后極顯著上升。

Pb2+鳳眼蓮 谷氨酰胺合成酶 谷氨酸合酶

鉛(Pb2+) 是環(huán)境污染最嚴重、危害最大的重金屬元素之一，屬“五毒”重金屬元素之一。鳳眼蓮()是多年生單子葉植物, 屬雨久花科鳳眼蘭屬, 原產(chǎn)于南美洲，是凈化水體的優(yōu)良植物材料[1]。近年來，國內(nèi)外有關鉛對水稻、小麥等農(nóng)作物氮代謝關鍵酶活性的影響已有較多報道[2],但研究Pb2+對鳳眼蓮氮代謝關鍵酶活性的影響的報道較少。

逆境對植物氮素代謝的影響是植物逆境生理研究的重要內(nèi)容之一。在高等植物中，無機氮以氨的形式摻入到碳骨架上，形成有機氮是最重要的生物化學過程之一，硝酸鹽還原產(chǎn)生的氨、光呼吸作用以及種子葉片儲存蛋白質(zhì)降解等過程產(chǎn)生的氨都是以氨基酸的形式同化成有機氮。谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶（GOGAT）耦聯(lián)形成的循環(huán)反應是高等植物體內(nèi)氨同化的主要途徑[3]。本實驗研究鳳眼蓮葉片和根在不同濃度Pb2+處理下的氮代謝關鍵酶的變化，旨在揭示重金屬Pb2+對鳳眼蓮營養(yǎng)代謝的約束機制，為研究鳳眼蓮對重金屬的凈化機制，以指導利用水生植物鳳眼蓮解決水體重金屬污染的實際問題提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗處理

鳳眼蓮采自福建省泉州惠安洛陽江水域，移取生長狀況良好、大小相近的鳳眼蓮于室內(nèi)自來水暫養(yǎng)3天后作為試驗材料；設定6組Pb2+濃度梯度對材料進行試驗培養(yǎng)；取6個大桶裝入15L的自來水，靜置3d曝氣后，分別加入不同濃度的Pb(NO3)2溶液攪勻，使得Pb2+濃度分別為0 mmol/L（對照）、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0 mmol/L,然后取18個大小一樣的水培盆(直徑約為35cm，高約為15cm)分別裝入處理后的水各4L（每種濃度為3個，培養(yǎng)盆共18個），取高度、長勢且根系長度較一致的鳳眼蓮栽入盆中,每盆3～4 株。培養(yǎng)6 h、6 d、20 d、60 d后分別取樣。

1.2 試驗測定方法

1.2.1酶液的提取

按文獻[4]的方法進行，重復3次。從每處理組的3盆中隨機剪取根、葉材料，各組稱取鳳眼蓮根、葉大約2g。立即加4mL抽提緩沖液冰浴快速研磨，將研磨液移入離心管，6℃離心22min（15000 rpm），上清液即為酶液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GS活性的測定

按文獻[5]的方法進行。1個GS活性單位定義為每分鐘于37℃產(chǎn)生1 μmol的γ-谷氨酰異羥肟酸所需的酶量。

1.2.3 NADH-GOGAT活性的測定

NADH-GOGAT活性測定按文獻[6]的方法進行。NADH-GOGAT酶活性單位定義為: 30℃每分鐘反應混合液減少1 μmol NADH為1個酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+對鳳眼蓮葉、根GS活性的影響

2.1.1 Pb2+脅迫對鳳眼蓮葉GS活性的影響

研究結(jié)果如圖1所示，脅迫6h后，0.25 mmol·L-1Pb2+處理使葉GS活性極顯著升高（P <0.01），其活性比對照組高出22.1%，在0.1 mmol·L-1、1 mmol·L-1和2 mmol·L-1Pb2+下，相對于無污染對照組，葉片的GS活性分別被抑制17.2%、22.3%和18.9%。脅迫6 d后，0.1～0.5 mmol·L-1Pb2+脅迫使葉片的GS活性極顯著降低，活性最低點在0.5 mmol·L-1Pb2+處，活性最高點在1 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出0.43%，當Pb2+濃度達2 mmol·L-1時，葉GS活性受抑制。脅迫20 d后，隨脅迫濃度的增加，葉GS活性呈現(xiàn)波浪型變化，在0.1 mmol·L-1Pb2+處理下略微上升，在0.25 mmol·L-1Pb2+處理下略微下降，然后在0.5 mmol·L-1Pb2+處顯著上升，又在1 mmol·L-1Pb2+處顯著下降，最后在2 mmol·L-1Pb2+處略微上升。脅迫60 d后，除1 mmol·L-1Pb2+處GS活性顯著下降其余各組均極顯著下降，活性最低點在2 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低43.9%。

另外從圖1可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，葉片的GS活性均出現(xiàn)不同程度的下降，脅迫6 d與脅迫6h相比差異顯著。但是脅迫60 d后，葉片的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升，1 mmol·L-1Pb2+脅迫60 d與脅迫20 d相比，其GS活性上升136%。

圖1 Pb2+對鳳眼蓮葉片GS活性的影響

（注：*表示差異達顯著水平，<0.05；**表示差異達極顯著水平，<0.01）

2.1.2 Pb2+脅迫對鳳眼蓮根GS活性的影響

研究結(jié)果如圖2所示，脅迫6h后，除1 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均極顯著下降，活性最低點在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低64.8%。脅迫6 d后，0. 5 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均出現(xiàn)不同程度下降，活性最低點在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低41.6%。脅迫20 d后，0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫使根的GS活性極顯著受抑制呈直線下降，與對照組相比，被抑制了41.7%～102%的活性；脅迫60 d后，0.1 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均出現(xiàn)不同程度下降，活性最低點在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低57.4%。

圖2 Pb2+對鳳眼蓮根GS活性的影響

（注：*表示差異達顯著水平，<0.05；**表示差異達極顯著水平，<0.01）

從圖2還可看出，隨著脅迫時間的增加，在同一處理濃度下根的GS活性均出現(xiàn)不同程度的下降，脅迫6 d與脅迫6h相比差異顯著，但是脅迫60 d后葉片的GS活性除了0.25 mmol·L-1Pb2+處略微下降，其余各處理濃度的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升。

2.2 Pb2+對鳳眼蓮葉、根NADH-GOGAT活性的影響

2.2.1 Pb2+對鳳眼蓮葉NADH-GOGAT活性的影響

研究結(jié)果如圖3所示，脅迫6 h后，各處理組NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度的下降，在0.25 mmol·L-1Pb2+處活性極顯著下降，其活性比對照組低17.2%。脅迫6 d后,在0.5 mmol·L-1Pb2+處活性顯著上升，其余各處理均未達到顯著性影響水平。脅迫20 d后，各處理組NADH- GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度下降，在1 mmol·L-1Pb2+處活性極顯著下降，與對照組相比，活性被抑制了31.3%。脅迫60 d后，除0.25 mmol·L-1處NADH-GOGAT活性略微上升外，其余各組均極顯著下降，活性最低點在2 mmol·L-1Pb2+處，與對照組相比，活性被抑制了67.2%。

另外，從圖3可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，葉片的NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度上升，脅迫60 d活性上升極顯著，0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫使葉片的NADH-GOGAT活性與脅迫6h相比上升了31.1%～427%。

圖3 Pb2+對鳳眼蓮葉片NADH-GOGAT活性的影響

（注：*表示差異達顯著水平，<0.05；**表示差異達極顯著水平，<0.01）

2.2.2 Pb2+對鳳眼蓮根NADH-GOGAT活性的影響

研究結(jié)果如圖4所示，脅迫6h后，除0.1 mmol·L-1Pb2+處NADH-GOGAT活性顯著下降，其余各處理均略微下降未達到顯著性影響水平。脅迫6 d后, 除0.25 mmol·L-1處NADH-GOGAT活性顯著下降，其余各處理均略微下降未達到顯著性影響水平。脅迫20 d后，0.1～1 mmol·L-1Pb2+處理使根NADH-GOGAT活性升高，活性最高點在0.1 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出91.1%，當Pb2+濃度達2 mmol·L-1Pb2+時，根NADH-GOGAT活性受抑制。脅迫60 d后，各處理組NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度上升，活性最高點在2 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出162%。

另外，從圖4可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，根的NADH-GOGAT活性未達到顯著性影響水平，除2 mmol·L-1Pb2+處理組根的NADH-GOGAT活性波動稍微大點，其余各組根的NADH-GOGAT活性都能保持在一定的范圍內(nèi)波動。

圖4 Pb2+對鳳眼蓮根NADH-GOGAT活性的影響

（注：*表示差異達顯著水平，<0.05；**表示差異達極顯著水平，<0.01）

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

在植物的生長發(fā)育過程中，氮素的同化是一個十分重要的生理過程，無機氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機氮才能為植物體所吸收和利用。其中由GS與GOGAT構(gòu)成的谷氨酸合酶循環(huán)是植物氮素同化的主要途徑，高等植物體內(nèi) 95%以上的NH4+通過GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶 /谷氨酸合成酶 )循環(huán)同化[7]，GS 和GOGAT的活性與植物體氮代謝能力密切相關。鳳眼蓮GS與GOGAT對1～2 mmol·L-1Pb2+污染脅迫的響應特點不盡相同，這可能與不同器官中GS/GOGAT循環(huán)的作用不盡相同有關。本試驗結(jié)果與林清華等[8]研究NaCl對水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脫氫酶的脅迫作用結(jié)果相似，鳳眼蓮和水稻一樣表現(xiàn)為葉的GS活性遠大于根的GS活性。研究結(jié)果體現(xiàn)鳳眼蓮根和葉的GS/GOGAT循環(huán)的作用有區(qū)別，以及提示鳳眼蓮葉和根的NH4+同化途徑有所不同。因為在綠色組織中，GS/GOGAT循環(huán)的主要作用是同化光呼吸產(chǎn)生的NH4+以及硝酸鹽在葉中還原產(chǎn)生的NH4+，在根中則是同化吸收到體內(nèi)的NH4+以及硝酸鹽被吸收后在根中還原產(chǎn)生的NH4+[8]。在各營養(yǎng)器官中，Pb2+處理對鳳眼蓮根的初級氮代謝影響最大，Pb2+污染使根同化NH4+的能力最為減弱，因此可能導致NH4+在根部的積累，氨濃度過高會對植物產(chǎn)生毒害，氨必須同化為體內(nèi)的有機含氮化合物，才能避免對植物的危害。從氮素代謝的角度看，Pb2+毒可能為植物帶來氨毒害。

鳳眼蓮根系對重金屬具有很強的吸附和吸收作用。因此，在水體凈化中可以選取像鳳眼蓮這樣根系發(fā)達的水生植物，凈化效果好，可應用于水體特別是一些封閉型水域如別墅區(qū)水系的治理中。同時，鳳眼蓮除了具有凈化水體的作用外，在開花季節(jié)還可增添水體景觀效果，只要適時撈取，便不會堵塞水體及河道。

3.2 結(jié)論

GS與GOGAT在鳳眼蓮的根、葉中均有分布，無論有無Pb2+污染存在，鳳眼蓮的根、葉的GS活性大于NADH- GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表現(xiàn)為葉＞根。 6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫均會使根和葉的GS活性降低，但在Pb2+脅迫60 d后，各處理濃度GS活性均出現(xiàn)不同程度的應激上升，鳳眼蓮葉片GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后極顯著上升。

[1] 李裕紅.鳳眼蓮對水環(huán)境污染的凈化作用研究概述[J].引進與咨詢，2006，（2）：82-83.

[2]Walsh G E,Ainsworth K A,Bigby R. Resistance of red mangrove(L.) seedlings to lead,cadmium and mercury[J]. Biotropica, 1979(11): 22-77.

[3] Lam H M, Coschigano K T, Oliveira I C, et al. The Molecular Genetics of Nitrogen Assimilation Into Amino Acids in Higher Plants[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Biol,1996(47):569-593.

[4] Zhang C F,Peng S B,Peng X X, et al. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice(L.)roots[J].Plant Sci., 1997 (125):163-170.

[5] Rhodes D, Rendo G A, Stewart G R. The Control of Glutamine Synthetase Level inL[J].Planta,1975(125):201-211.

[6] Lin C C, Kao C H. Disturbed ammonium assimilation is associated with growth inhibition of roots in rice seedlings caused by NaCl[J]. Plant Growth Regul., 1996(18):233-238.

[7]莫良玉，吳良歡，陶勤南. 高等植物GS/GOGAT循環(huán)研究進展[J].植物營養(yǎng)與肥料學報, 2001,7(2): 223-231.

[8] 林清華, 李常健, 彭進, 等. NaCl對水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脫氫酶的脅迫作用[J].武漢植物學研究, 2000,18(3):206-210.

李裕紅。