泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 洪偉超 李裕紅 徐旸旸

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鉛脅迫對鳳眼蓮氮代謝關(guān)鍵酶的影響

泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 洪偉超 李裕紅*徐旸旸

該文研究了系列濃度Pb2+脅迫6h、6d、20d、60d對鳳眼蓮氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明：無論有無Pb2+污染存在，鳳眼蓮的根、葉的GS活性大于NADH-GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表現(xiàn)為葉＞根。6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫均使根和葉的GS活性降低，但在Pb2+脅迫60 d后，隨著鳳眼蓮新生組織的萌生，各處理濃度組的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升，鳳眼蓮葉片的GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后極顯著上升。

Pb2+鳳眼蓮 谷氨酰胺合成酶 谷氨酸合酶

鉛(Pb2+) 是環(huán)境污染最嚴(yán)重、危害最大的重金屬元素之一，屬“五毒”重金屬元素之一。鳳眼蓮()是多年生單子葉植物, 屬雨久花科鳳眼蘭屬, 原產(chǎn)于南美洲，是凈化水體的優(yōu)良植物材料[1]。近年來，國內(nèi)外有關(guān)鉛對水稻、小麥等農(nóng)作物氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響已有較多報道[2],但研究Pb2+對鳳眼蓮氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響的報道較少。

逆境對植物氮素代謝的影響是植物逆境生理研究的重要內(nèi)容之一。在高等植物中，無機(jī)氮以氨的形式摻入到碳骨架上，形成有機(jī)氮是最重要的生物化學(xué)過程之一，硝酸鹽還原產(chǎn)生的氨、光呼吸作用以及種子葉片儲存蛋白質(zhì)降解等過程產(chǎn)生的氨都是以氨基酸的形式同化成有機(jī)氮。谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶（GOGAT）耦聯(lián)形成的循環(huán)反應(yīng)是高等植物體內(nèi)氨同化的主要途徑[3]。本實(shí)驗(yàn)研究鳳眼蓮葉片和根在不同濃度Pb2+處理下的氮代謝關(guān)鍵酶的變化，旨在揭示重金屬Pb2+對鳳眼蓮營養(yǎng)代謝的約束機(jī)制，為研究鳳眼蓮對重金屬的凈化機(jī)制，以指導(dǎo)利用水生植物鳳眼蓮解決水體重金屬污染的實(shí)際問題提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理

鳳眼蓮采自福建省泉州惠安洛陽江水域，移取生長狀況良好、大小相近的鳳眼蓮于室內(nèi)自來水暫養(yǎng)3天后作為試驗(yàn)材料；設(shè)定6組Pb2+濃度梯度對材料進(jìn)行試驗(yàn)培養(yǎng)；取6個大桶裝入15L的自來水，靜置3d曝氣后，分別加入不同濃度的Pb(NO3)2溶液攪勻，使得Pb2+濃度分別為0 mmol/L（對照）、0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0 mmol/L,然后取18個大小一樣的水培盆(直徑約為35cm，高約為15cm)分別裝入處理后的水各4L（每種濃度為3個，培養(yǎng)盆共18個），取高度、長勢且根系長度較一致的鳳眼蓮栽入盆中,每盆3～4 株。培養(yǎng)6 h、6 d、20 d、60 d后分別取樣。

1.2 試驗(yàn)測定方法

1.2.1酶液的提取

按文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行，重復(fù)3次。從每處理組的3盆中隨機(jī)剪取根、葉材料，各組稱取鳳眼蓮根、葉大約2g。立即加4mL抽提緩沖液冰浴快速研磨，將研磨液移入離心管，6℃離心22min（15000 rpm），上清液即為酶液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GS活性的測定

按文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。1個GS活性單位定義為每分鐘于37℃產(chǎn)生1 μmol的γ-谷氨酰異羥肟酸所需的酶量。

1.2.3 NADH-GOGAT活性的測定

NADH-GOGAT活性測定按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行。NADH-GOGAT酶活性單位定義為: 30℃每分鐘反應(yīng)混合液減少1 μmol NADH為1個酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+對鳳眼蓮葉、根GS活性的影響

2.1.1 Pb2+脅迫對鳳眼蓮葉GS活性的影響

研究結(jié)果如圖1所示，脅迫6h后，0.25 mmol·L-1Pb2+處理使葉GS活性極顯著升高（P <0.01），其活性比對照組高出22.1%，在0.1 mmol·L-1、1 mmol·L-1和2 mmol·L-1Pb2+下，相對于無污染對照組，葉片的GS活性分別被抑制17.2%、22.3%和18.9%。脅迫6 d后，0.1～0.5 mmol·L-1Pb2+脅迫使葉片的GS活性極顯著降低，活性最低點(diǎn)在0.5 mmol·L-1Pb2+處，活性最高點(diǎn)在1 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出0.43%，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)2 mmol·L-1時，葉GS活性受抑制。脅迫20 d后，隨脅迫濃度的增加，葉GS活性呈現(xiàn)波浪型變化，在0.1 mmol·L-1Pb2+處理下略微上升，在0.25 mmol·L-1Pb2+處理下略微下降，然后在0.5 mmol·L-1Pb2+處顯著上升，又在1 mmol·L-1Pb2+處顯著下降，最后在2 mmol·L-1Pb2+處略微上升。脅迫60 d后，除1 mmol·L-1Pb2+處GS活性顯著下降其余各組均極顯著下降，活性最低點(diǎn)在2 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低43.9%。

另外從圖1可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，葉片的GS活性均出現(xiàn)不同程度的下降，脅迫6 d與脅迫6h相比差異顯著。但是脅迫60 d后，葉片的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升，1 mmol·L-1Pb2+脅迫60 d與脅迫20 d相比，其GS活性上升136%。

圖1 Pb2+對鳳眼蓮葉片GS活性的影響

（注：*表示差異達(dá)顯著水平，<0.05；**表示差異達(dá)極顯著水平，<0.01）

2.1.2 Pb2+脅迫對鳳眼蓮根GS活性的影響

研究結(jié)果如圖2所示，脅迫6h后，除1 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均極顯著下降，活性最低點(diǎn)在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低64.8%。脅迫6 d后，0. 5 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均出現(xiàn)不同程度下降，活性最低點(diǎn)在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低41.6%。脅迫20 d后，0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫使根的GS活性極顯著受抑制呈直線下降，與對照組相比，被抑制了41.7%～102%的活性；脅迫60 d后，0.1 mmol·L-1Pb2+處GS活性略微上升，其余各組均出現(xiàn)不同程度下降，活性最低點(diǎn)在0.25 mmol·L-1Pb2+處，其活性比對照組低57.4%。

圖2 Pb2+對鳳眼蓮根GS活性的影響

（注：*表示差異達(dá)顯著水平，<0.05；**表示差異達(dá)極顯著水平，<0.01）

從圖2還可看出，隨著脅迫時間的增加，在同一處理濃度下根的GS活性均出現(xiàn)不同程度的下降，脅迫6 d與脅迫6h相比差異顯著，但是脅迫60 d后葉片的GS活性除了0.25 mmol·L-1Pb2+處略微下降，其余各處理濃度的GS活性均出現(xiàn)不同程度的上升。

2.2 Pb2+對鳳眼蓮葉、根NADH-GOGAT活性的影響

2.2.1 Pb2+對鳳眼蓮葉NADH-GOGAT活性的影響

研究結(jié)果如圖3所示，脅迫6 h后，各處理組NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度的下降，在0.25 mmol·L-1Pb2+處活性極顯著下降，其活性比對照組低17.2%。脅迫6 d后,在0.5 mmol·L-1Pb2+處活性顯著上升，其余各處理均未達(dá)到顯著性影響水平。脅迫20 d后，各處理組NADH- GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度下降，在1 mmol·L-1Pb2+處活性極顯著下降，與對照組相比，活性被抑制了31.3%。脅迫60 d后，除0.25 mmol·L-1處NADH-GOGAT活性略微上升外，其余各組均極顯著下降，活性最低點(diǎn)在2 mmol·L-1Pb2+處，與對照組相比，活性被抑制了67.2%。

另外，從圖3可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，葉片的NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度上升，脅迫60 d活性上升極顯著，0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫使葉片的NADH-GOGAT活性與脅迫6h相比上升了31.1%～427%。

圖3 Pb2+對鳳眼蓮葉片NADH-GOGAT活性的影響

（注：*表示差異達(dá)顯著水平，<0.05；**表示差異達(dá)極顯著水平，<0.01）

2.2.2 Pb2+對鳳眼蓮根NADH-GOGAT活性的影響

研究結(jié)果如圖4所示，脅迫6h后，除0.1 mmol·L-1Pb2+處NADH-GOGAT活性顯著下降，其余各處理均略微下降未達(dá)到顯著性影響水平。脅迫6 d后, 除0.25 mmol·L-1處NADH-GOGAT活性顯著下降，其余各處理均略微下降未達(dá)到顯著性影響水平。脅迫20 d后，0.1～1 mmol·L-1Pb2+處理使根NADH-GOGAT活性升高，活性最高點(diǎn)在0.1 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出91.1%，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)2 mmol·L-1Pb2+時，根NADH-GOGAT活性受抑制。脅迫60 d后，各處理組NADH-GOGAT活性均出現(xiàn)不同程度上升，活性最高點(diǎn)在2 mmol·L-1Pb2+脅迫組，其活性比對照組高出162%。

另外，從圖4可以看出，在同一處理濃度下隨著脅迫時間的增加，根的NADH-GOGAT活性未達(dá)到顯著性影響水平，除2 mmol·L-1Pb2+處理組根的NADH-GOGAT活性波動稍微大點(diǎn)，其余各組根的NADH-GOGAT活性都能保持在一定的范圍內(nèi)波動。

圖4 Pb2+對鳳眼蓮根NADH-GOGAT活性的影響

（注：*表示差異達(dá)顯著水平，<0.05；**表示差異達(dá)極顯著水平，<0.01）

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

在植物的生長發(fā)育過程中，氮素的同化是一個十分重要的生理過程，無機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機(jī)氮才能為植物體所吸收和利用。其中由GS與GOGAT構(gòu)成的谷氨酸合酶循環(huán)是植物氮素同化的主要途徑，高等植物體內(nèi) 95%以上的NH4+通過GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶 /谷氨酸合成酶 )循環(huán)同化[7]，GS 和GOGAT的活性與植物體氮代謝能力密切相關(guān)。鳳眼蓮GS與GOGAT對1～2 mmol·L-1Pb2+污染脅迫的響應(yīng)特點(diǎn)不盡相同，這可能與不同器官中GS/GOGAT循環(huán)的作用不盡相同有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果與林清華等[8]研究NaCl對水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脫氫酶的脅迫作用結(jié)果相似，鳳眼蓮和水稻一樣表現(xiàn)為葉的GS活性遠(yuǎn)大于根的GS活性。研究結(jié)果體現(xiàn)鳳眼蓮根和葉的GS/GOGAT循環(huán)的作用有區(qū)別，以及提示鳳眼蓮葉和根的NH4+同化途徑有所不同。因?yàn)樵诰G色組織中，GS/GOGAT循環(huán)的主要作用是同化光呼吸產(chǎn)生的NH4+以及硝酸鹽在葉中還原產(chǎn)生的NH4+，在根中則是同化吸收到體內(nèi)的NH4+以及硝酸鹽被吸收后在根中還原產(chǎn)生的NH4+[8]。在各營養(yǎng)器官中，Pb2+處理對鳳眼蓮根的初級氮代謝影響最大，Pb2+污染使根同化NH4+的能力最為減弱，因此可能導(dǎo)致NH4+在根部的積累，氨濃度過高會對植物產(chǎn)生毒害，氨必須同化為體內(nèi)的有機(jī)含氮化合物，才能避免對植物的危害。從氮素代謝的角度看，Pb2+毒可能為植物帶來氨毒害。

鳳眼蓮根系對重金屬具有很強(qiáng)的吸附和吸收作用。因此，在水體凈化中可以選取像鳳眼蓮這樣根系發(fā)達(dá)的水生植物，凈化效果好，可應(yīng)用于水體特別是一些封閉型水域如別墅區(qū)水系的治理中。同時，鳳眼蓮除了具有凈化水體的作用外，在開花季節(jié)還可增添水體景觀效果，只要適時撈取，便不會堵塞水體及河道。

3.2 結(jié)論

GS與GOGAT在鳳眼蓮的根、葉中均有分布，無論有無Pb2+污染存在，鳳眼蓮的根、葉的GS活性大于NADH- GOGAT活性，且GS活性和NADH-GOGAT活性均表現(xiàn)為葉＞根。 6h、6d、20d的 0.1～2 mmol·L-1Pb2+脅迫均會使根和葉的GS活性降低，但在Pb2+脅迫60 d后，各處理濃度GS活性均出現(xiàn)不同程度的應(yīng)激上升，鳳眼蓮葉片GOGAT活性在Pb2+暴露60 d后極顯著上升。

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李裕紅。