劉文麗，張?zhí)m威，* ，John shi，易華西

(1.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090;2.加拿大農(nóng)業(yè)部圭爾夫食品研究中心，安大略省圭爾夫N1G5C9)

近年來，隨著涉及食品病原菌和腐敗菌的食品安全事故頻繁爆發(fā)，人們越來越關注食品安全問題［1］。利用乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質尤其是細菌素來抑制食品腐敗菌和致病菌越來越得到人們的認同，乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中由核糖體產(chǎn)生的多肽。Ⅱa類乳酸菌細菌素是一類乳酸菌產(chǎn)生的具有N端保守序列YGNGVXCXXXXCXV，包括形成二硫鍵的Cys且對李斯特氏菌具有強烈抗菌活性的非羊毛硫氨酸修飾的熱穩(wěn)定性多肽［2］，與其它細菌素相比，由于Ⅱa類乳酸菌細菌素對食品典型的致病菌李斯特氏菌具有更強的抗菌活性和更好的物理化學性質，因此目前被認為是很有發(fā)展前途的細菌素［3－5］。為了能更深入地了解Ⅱa類乳酸菌細菌素，使其更有利于應用于食品工業(yè)，深入了解乳酸菌細菌素結構和功能關系是必要的。Ⅱa類乳酸菌細菌素構效關系的研究現(xiàn)在涉及到的主要有細菌素的結構域及結構模型、Ⅱa類乳酸菌細菌素對目標指示菌細胞膜的作用過程、細菌素各結構域與細菌素抗菌活性的關系，下面分別進行陳述。

1 Ⅱa類乳酸菌細菌素的結構域及結構模型

通過對近年來Ⅱa類乳酸菌細菌素構效關系研究的總結［6－9］，預測Ⅱa類乳酸菌細菌素的結構域可能是由N端保守序列YGNGV形成的β轉角結構、N端β折疊形成的親水性N端、中間區(qū)域形成的親水或兩親性α螺旋、C端疏水區(qū)域形成的兩親性α螺旋組成［6－9］(如圖 1a)，這些結構域連在一起就組成了Ⅱa類乳酸菌細菌素的結構模型。

2 Ⅱa類乳酸菌細菌素對目標指示菌細胞膜的作用過程

Ⅱa類乳酸菌細菌素對目標指示菌細胞膜的作用過程主要分為兩步。第一步主要是Ⅱa類乳酸菌細菌素通過靜電作用與目標指示菌結合(如圖1b)，由于Ⅱa類乳酸菌細菌素的N端β轉角結構，使N端保守序列YGNGV很容易暴露并被假想的目標指示菌的細胞膜表面(膜結合受體分子)識別，這將能夠使Ⅱa類乳酸菌細菌素在目標膜表面正確的定位(如圖1b①)。細菌素正確定位后，Ⅱa類乳酸菌細菌素的β折疊通過靜電作用與膜結合受體分子結合，這就使Ⅱa類乳酸菌細菌素的β轉角和β折疊都與膜結合受體分子結合(如圖1b②)。第二步，如圖1C，Ⅱa類乳酸菌細菌素的中間區(qū)域的傾斜α螺旋和C端疏水區(qū)域兩親性α螺旋通過疏水作用與膜結合受體分子結合，使整個Ⅱa類乳酸菌細菌素都與膜結合受體分子結合(如圖1C③)，由于C端疏水性比N端強，因此大多數(shù)情況下，Ⅱa類乳酸菌細菌素是通過C端和目標細胞膜的疏水相互作用，而使Ⅱa類乳酸菌細菌素重新定位和插入膜內(nèi)部，這樣兩個Ⅱa類乳酸菌細菌素共同作用目標指示菌細胞膜，就使目標指示菌細胞膜內(nèi)組分被泄露或溢出，從而促成孔洞的形成;極少數(shù)情況下，Ⅱa類乳酸菌細菌素的N端在膜結合受體分子的兩側相同的位點共同作用，然后，兩側的C端同時通過疏水作用重新定位和插入目標指示菌細胞膜內(nèi)，從而同樣導致目標指示菌細胞膜內(nèi)組分被泄露或溢出，形成孔洞(如圖1C④)。

3 Ⅱa類乳酸菌細菌素各結構域與抗菌活性的關系

3.1 Ⅱa類乳酸菌細菌素N端保守序列YGNGV與抗菌活性的關系

一種假說認為保守序列YGNGV可能與Ⅱa類細菌素的作用機制的識別步驟有關［10］，與作用的專一性無關［6］，這一假說還沒有明確的實驗證實，但替換和刪除保守序列YGNGV對Ⅱa類細菌素抑制李斯特活性的影響卻有確切報道。Fleury Y等［11］為了研究mesentericinY10537N端保守序列與mesentericin Y 10537抗李斯特活性的關系，通過酶水解或固相合成刪除N端，結果顯示刪除N端將導致細菌素降低10000倍的抗李斯特活性。Quadri等［12］對 CarnobacteriumpiscicolaLV17B產(chǎn) 生的Carnobacteriocin B2的48個氨基酸序列的第3、33、34、37、46位的氨基酸替換，將第28位氨基酸刪除，研究結果表明對細菌素的氨基酸序列進行較小的變動都會導致細菌素抗菌活性的消失和很大程度的降低，細菌素產(chǎn)量也會受到很大影響，特別是 N端。Miller等［13］通過測定Ⅱa類細菌素pediocin AcH合成和分泌的最小需要，結果表明Ⅱa類細菌素pediocin AcH N端并沒有橫跨膜結合受體分子，但N端保守序列 Lys+1－Tyr－Tyr－Gly－Asn－Gly－Val+7－對pediocin AcH是非常重要的，因為刪除這個序列，pediocin AcH的抗菌活性消失。Jitka Rihakova等［14］利用單個氨基酸替換產(chǎn)生單氨酸替換突變體，并利用合成基因在大腸桿菌中表達，從而產(chǎn)生一個重組的細菌素DvnRV41，這個重組的細菌素在N端區(qū)域具有4個額外的氨基酸，原因是利用酶水解并保持原有細菌素DvnV41的抗菌活性，為了了解DvnV41的構效關系，Jitka Rihakova利用單個氨基酸替換保守序列中的氨基酸或者C端的氨基酸，從而產(chǎn)生8株單氨酸替換突變體，來研究Ⅱa類細菌素DvnV41的構效關系，研究結果表明替換保守序列中的氨基酸將降低Divercin V41對李斯特氏菌的抗菌活性。此外，Ⅱa類細菌素除了具有典型的保守序列YGNGV，有的還是 YGNGV和 YGNGL，例如，Tomita H等［15］比較了Enterococcus faecalis YI717產(chǎn)生保守序列為YGNGL的bacteriocin 31與保守序列為YGNGV的其它Ⅱa類細菌素氨基酸序列的相似性進行比較，結果表明Ⅱa類細菌素的N端序列具有高度的相似性，表明N端保守序列對Ⅱa類細菌素的抗菌活性有重 要 影 響。Kanatani K 等［16］對 Lactobacillus acidophilusTK9201產(chǎn)生的細菌素 acidocinA(YGTNGV)的研究結果表明Ⅱa類乳酸菌細菌素的保守序列對細菌素的抗李斯特活性有影響。因此，刪除或替換YGNGV保守序列將擾亂β轉角結構和N端β折疊結構，最終影響的不僅是抑制李斯特氏菌的活性，還包括對其它目標指示菌的抗菌活性。

3.2 N端親水β折疊與抗菌活性的關系

N端β折疊結構使Ⅱa類細菌素具有兩親特性，使細菌素和膜表面通過靜電作用進行細菌素對膜的識別步驟(如圖1b②)。這個假說已經(jīng)被chen等［3］所證實，他的研究結果表明pediocin PA－1的N端β折疊的親水片段 Lys－1，Lys－11 and His－12，是用來調(diào)節(jié)細菌素與目標指示菌細胞膜作用的，而位于pediocinPA－1發(fā)夾環(huán)的尖端的疏水片段 Val－7，Cys－9和 Cys－14，Val－16 和 Trp－18 主要是用來調(diào)節(jié)細菌素插入目標指示菌細胞膜的過程。Havarstein，L.S等［17］、Miller，K.W 等［18］和 Quadri，L.E.N 等［12］的研究結果表明，不具有 N端延伸、具有前導肽prebacteriocins或者具有麥芽糖結合蛋白 MBP－pediocin AcH的Ⅱa類細菌素N端部分并沒有插入目標菌株細胞膜的磷脂雙分子層，且和成熟肽相比，前導肽的活性是非常弱的，可能是因為前導肽干涉了細菌素和膜的結合。這些研究都支持了N端β折疊結構涉及了細菌素和膜表面通過靜電作用進行細菌素對膜的識別步驟。Deegan 等［19］和 Kazazic 等［20］也證實了帶電荷的親水N端β折疊結構通過靜電作用與目標指示菌細胞膜上的帶陰離子磷脂頭部的極性殘基結合。

3.3 中心區(qū)域形成的親水或兩親傾斜α螺旋與抗菌活性的關系

Ⅱa類細菌素中心區(qū)域的傾斜α螺旋主要涉及細菌素對目標膜受體分子的重新定位和插入功能，如圖1C③。對于這一假說觀點的研究支持，目前報道較少。Bennik等［21］的研究結果表明九個Ⅱa類細菌素都擁有傾斜的α螺旋結構(跨越殘基15、16、27、28)，這些螺旋結構能夠以40°角插入疏水－親水表面，因此能夠促進細菌素分子插入到目標菌株的細胞質膜;Fimland 等［22］通過結合 pediocin PA－1，sakacin P and curvacin A(sakacin A)的N端部分(殘基1－21)和這些細菌素的C端部分構建雜交的Ⅱa類細菌素，分別描述為 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak和Sak－Cur，這些雜交的Ⅱa類細菌素都包含α螺旋區(qū)域，但只有Ped－Sak(結合 pediocin PA－1的1－21殘基和sakacin P末端的22殘基)具有傾斜的α螺旋結構域，因此只有Ped－Sak能夠以45°角插入到目標膜的疏水－親水表面，并且保持了和原始細菌素同樣的抗菌活性。

3.4 C端疏水區(qū)域形成的兩親性α螺旋與抗菌活性的關系

如圖1C③和④，Ⅱa類細菌素的疏水C端和兩親α螺旋參與了細菌素插入目標膜受體分子的磷脂雙分子層和導致細胞內(nèi)容物泄露及溢出的過程［23－24］。與N端不同的是，C端區(qū)域包含假定的跨膜螺旋，這些跨膜螺旋使Ⅱa類細菌素的C端區(qū)域具有更多的多樣性，并且這些細菌素對目標指示菌的專一性有一定作用。Fimland等［22］通過對雜交細菌素 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak 和 Sak－Cur的結構觀察表明C端是Ⅱa類細菌素抑制目標指示菌的主要結構域，并且是膜識別的重要結構域。Fimland等［25］對pediocin－PA－1的研究結果證實了 pediocin－PA－1的C端(20－34個殘基)是插入目標膜受體分子的決定結構域，對膜識別區(qū)域有非常重要的作用，此外，pediocin－PA－1的C端影響 pediocin－PA－1的活性，可能是在目標膜上的疏水區(qū)域被占據(jù)的結果。Jitka Rihakova等［14］利用單個氨基酸替換產(chǎn)生位點突變菌株，研究了C端區(qū)域對Divercin V41抗菌活性的影響，研究結果表明刪除C端區(qū)域將降低Divercin V41的抗菌活性。Hele'n Sophie Haugen等［26］的研究表明pediocin PA－1 C端螺旋區(qū)域片段顯示的抗菌活性是pediocin PA－1的一半。Todorov等也指出C端是細菌素區(qū)別目標細胞特異性的關鍵結構域［27］。

4 二硫鍵與抗菌活性的關系

所有Ⅱa類細菌素都至少包含一個二硫鍵，二硫鍵對Ⅱa類細菌素的抗菌活性也可能有一定的影響。趙愛珍等［28］依據(jù)Enterocin A的氨基酸序列，設計半胱氨酸替換突變體Enterocin A(C14S)和Enterocin A(C47W)，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得重組突變體。用還原劑β－巰基乙醇處理MBP－Enterocin A，采用瓊脂擴散實驗檢測重組Enterocin A、突變體及還原產(chǎn)物的抗無害李斯特菌LIN3活性，結果表明:N末端融合部分不含有半胱氨酸的MBP－Enterocin A或His tag－Enterocin A均表現(xiàn)強抗菌活性;而N末端融合部分含有半胱氨酸的GST－Enterocin A，表現(xiàn)很弱的抗菌活性;半胱氨酸替換突變體及MBP－Enterocin A還原產(chǎn)物均不顯示抗菌活性。實驗結果證明二硫鍵是Enterocin A抗菌活性的重要影響因素。Clarissa S.Sit等［29］為了探討 leucocin A的構效關系，在建立leucocin A的3D結構以后，利用化學合成的方法合成了一系列代替第9和第14位殘基的結構類似物［26，28］，研究結果表明，二硫鍵用 C 環(huán)替代后將會導致 leucocin A 活性降低10倍。Clarissa S.Sit等［30］揭示了未激活(C9S，C14S)－leucocin A和激活(C9L，C14L)－leucocin A的3D溶液結構，結果表明利用Ser和Leu來替換兩個cys殘基，并沒有影響到抗菌肽的電荷，因此可以說明二硫鍵并沒有干涉到細菌素與目標菌體細胞膜的靜電相互作用。

圖1 Ⅱa類細菌素的結構模型及對目標細胞膜的假設作用位點［31］Fig.1 Schanatic representation of the structure of a modelⅡa bacteriocin and the predicted location its domains with respect to target cell membrane［31］

5 陽離子氨基酸與抗菌活性的關系

由于含有陽離子氨基酸的Ⅱa類細菌素不能有效地與細胞膜表面結合，從而使Ⅱa類細菌素抗菌活性減弱，研究者們相繼證實了這一觀點。Miller KW等［2］研究表明在 pediocin AcH中的陽離子氨基酸Lys－1，His－42 and Lys－43 使抗菌活性減少，主要原因是細菌素不能有效地與細胞膜表面結合。相反，Chen等［3］研究表明突變的 pediocin PA－1殘基由于缺少帶陽離子的Lys－11和 His－12，以至于不能與目標細胞膜結合，從而使抗菌活性消失。此外，還有一種觀點認為pediocin PA－1三個His殘基的質子化對于目標細胞膜的吸附作用最大，pediocin PA－1的Lys－11對于目標細胞膜孔的形成非常重要。

6 其它氨基酸與抗菌活性的關系

Miller KW等［2］研究結果表明用色氨酸 Trp－18代替pediocin PA－1中的精氨酸Arg會導致兩個數(shù)量級的抗菌活性損失。對于大多數(shù)Ⅱa類細菌素來說，這個位置的Trp是很好的保留殘基。相似的，去除N端Trp殘基，mesentericin Y105的抗李斯特活性也戲劇性地降低。D J Derksen等［32］利用不相關的氨基酸代替leucocin A 9位和14位的胱氨酸，結果表明替換后的細菌素與leucocin A相比，活性并沒有改變，為了解釋這一現(xiàn)象D.J.Derksen提出了一種假說認為側鏈之間的相互作用可能使第9位和第14位殘基之間形成一個環(huán)，從而維持細菌素活性的形成［29，33］。

7 結論

目前，Ⅱa類乳酸菌細菌素的構效關系還沒有研究透徹，主要停留在報道較多的細菌素上，如pediocin PA－1、Enterocin A 等，對近些年來新分離出的具有較強、廣譜抗菌活性的Ⅱa類乳酸菌細菌素構效關系的研究較少。因此，未來的研究如果能擴大研究范圍必定會取得突破性成果，也為未來Ⅱa類乳酸菌細菌素的實際應用提供理論依據(jù)和指導。另外，利用Ⅱa類乳酸菌細菌素的結構與功能的關系來研究和獲得具有抗菌活性強、抗菌譜寬、穩(wěn)定性高的細菌素或類似物也是一個很好的研究方向。

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