費(fèi)湘?zhèn)?，桑衛(wèi)國(guó)

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211；2.寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波315211）

蜜桔，屬于蕓香科，和釉子、橙子、花椒、枳同屬一科，其維生素C含量是蘋(píng)果的6～20倍。蜜桔采摘后的自然壽命為1～2周，經(jīng)過(guò)化學(xué)防腐處理之后，在常溫下可貯藏一個(gè)月左右，但質(zhì)量劣化迅速，喪失固有甜味。化學(xué)防腐劑由于長(zhǎng)期連續(xù)的在水果貯藏中應(yīng)用造成了藥物的高毒高殘留問(wèn)題，這越來(lái)越受到消費(fèi)者們的關(guān)注。蜜桔在采后貯藏期間的主要病害為青霉病和綠霉病。目前普遍采用的抑菌保鮮方法為涂膜保鮮，殼聚糖是主要的涂膜材料，但由于涂膜成分單一，且物質(zhì)本身并沒(méi)有殺菌作用，存在一定的不足。而在成膜物質(zhì)中另外添加殺菌劑（如植物精油），可以達(dá)到改善膜的機(jī)械性能，提高涂膜對(duì)果蔬的防腐保鮮能力[1-3]。芥末油作為一種天然的植物精油，是以黑芥子或者白芥子經(jīng)榨取而得來(lái)的一種調(diào)味汁，具有強(qiáng)烈的刺激味，其主成分為異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate），含量在90%以上。有文獻(xiàn)研究表明，異硫氰酸烯丙酯具有抑菌活性，可以達(dá)到抑菌目的。且相對(duì)于果蔬采后的其他病原菌如灰霉菌，鏈格孢以及炭疽病菌，芥末油對(duì)青霉菌的抑菌效果最好[4-9]。本實(shí)驗(yàn)以新鮮采摘下的蜜桔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，殼聚糖作為成膜劑，輔以芥末精油，復(fù)配制成可食性的復(fù)合保鮮液，對(duì)蜜桔進(jìn)行涂膜處理，研究其對(duì)采后貯藏期間病原菌的抑菌作用及貯藏效果。這不僅為蜜桔的貯藏研發(fā)一種新型的、綠色的保鮮方法，也為天然植物的提取物在果蔬采后保鮮上的應(yīng)用提供借鑒和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥末精油 Sigma-aldrich公司，94%的Allyl isothiocyanate；供試蜜桔 新鮮采摘，從果園直接托運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，挑選成熟度、大小相對(duì)一致，無(wú)病蟲(chóng)害，表面無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，進(jìn)行簡(jiǎn)單處理[10]；腐敗菌 從已發(fā)霉腐敗的蜜桔中分離純化而得，菌懸液用0.9%生理鹽水稀釋，借助血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整至一定菌數(shù)的孢子懸浮液；殼聚糖 CTS，食品級(jí)，脫乙酰度≥90%；冰乙酸 分析純，乙酸含量99.5%。

BX51型系統(tǒng)顯微鏡 日本OLYMPUS公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；磁力攪拌器 上海青浦滬西儀器廠；電子稱 上海鼎源衡器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌保鮮液的復(fù)配 果實(shí)貯藏效果實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)果實(shí)處理后感官分析，芥末油濃度為40、80、120μL/mL的復(fù)合液涂膜處理后，果實(shí)表面芥末油氣味人體可接受。先以1%的冰醋酸作溶劑，配成1%的殼聚糖溶液。殼聚糖完全溶解，無(wú)分層現(xiàn)象出現(xiàn)。再在1%的殼聚糖溶液中加入芥末精油，于磁力攪拌器上快速攪拌均勻，配成一定芥末油濃度的復(fù)配液。抑菌效果實(shí)驗(yàn)中，由于高濃度的芥末油對(duì)青霉菌的抑菌效果極強(qiáng)，經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)參考，配制成芥末油濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125μL/mL的低濃度梯度的復(fù)合液。菌絲生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中，為了抑菌圈的明顯，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)分析，分別配成芥末油濃度為1.25、2.5、5.0、10、30μL/mL的復(fù)合液。

1.2.2 腐敗菌的分離純化及鑒定 取貯藏期間的腐敗蜜桔，用接種環(huán)挑取少量孢子菌絲于新鮮PDA培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從形態(tài)上觀察各菌落，挑選疑似菌落（綠色菌落，菌落周圍長(zhǎng)有白色菌絲），進(jìn)一步接種劃線至另一新PDA培養(yǎng)基上，如此連續(xù)培養(yǎng)，直至得到純化菌種，并進(jìn)行電鏡觀察。純化出的菌種接種至斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱中保存。

1.2.3 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]的方法，最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定：用無(wú)菌吸管吸取各不同芥末油濃度的復(fù)配液1mL，分別注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入9mL無(wú)菌培養(yǎng)基，輕輕混勻待冷卻成含抑菌劑的雙碟平皿，編號(hào)。再用無(wú)菌移液槍頭取測(cè)試菌懸液100μL于雙碟平皿表面，涂布均勻，每個(gè)處理三個(gè)平行。置26℃恒溫箱中，培養(yǎng)48h，觀察測(cè)試菌的生長(zhǎng)情況。以完全沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)的芥末油濃度作為該抑菌劑的最低抑菌濃度（MIC）。

最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定：將上述沒(méi)有長(zhǎng)菌的雙碟平皿繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察測(cè)試菌的生長(zhǎng)情況。以完全沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)的芥末油濃度作為該抑菌劑的最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.4 對(duì)菌絲生長(zhǎng)活性的影響 用無(wú)菌移液槍頭取1mL一定稀釋倍數(shù)（10-4）的菌懸液與9mL無(wú)菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中混勻，待5min凝固后，在培養(yǎng)基上分別放置浸有單殼聚糖液，1.25、2.5、5.0、10、30μL/mL芥末油的復(fù)配液的無(wú)菌圓濾紙片（直徑6mm），另設(shè)蘸取無(wú)菌水的濾紙片作為空白組，每皿4個(gè)平行點(diǎn)。各處理組均置于26℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5d后，用量尺測(cè)量透明圈的直徑大小。每個(gè)處理三次重復(fù)，取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。并應(yīng)用SPSS 19.0 One-Way ANOVA（p=0.05）進(jìn)行方差分析，比較同一因素不同處理之間的差異顯著性。

1.2.5 樣品抑菌實(shí)驗(yàn) 將擦凈的果實(shí)直接分別進(jìn)行40、80、120μL/mL的不同芥末油濃度復(fù)配液的涂膜處理，同時(shí)設(shè)置不作任何處理的自然條件下的果實(shí)作為對(duì)照組，所有果實(shí)均裝入聚乙烯塑料薄膜袋中，置于20℃溫度，相對(duì)濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中貯藏，每隔7d測(cè)一次各組的重量及查看果實(shí)的腐爛級(jí)別及個(gè)數(shù)，并計(jì)算失水率及腐爛指數(shù)。

1.2.6 測(cè)定指標(biāo)及方法 抑菌圈直徑測(cè)量：采用量尺測(cè)量。腐爛指數(shù)[12]：根據(jù)果實(shí)腐爛程度將果實(shí)分級(jí)：0級(jí)—無(wú)腐爛；1級(jí)—輕微腐爛，但腐爛部分小于1/10；2級(jí)—腐爛部分為1/10～1/6；3級(jí)—腐爛部分為1/6～1/4；4級(jí)—全部腐爛1/4～1/2；5級(jí)—全部腐爛1/2～3/4；6級(jí)—全部腐爛。

腐爛指數(shù)＝∑（各級(jí)果數(shù)×腐爛級(jí)數(shù)）/（總果數(shù)×最高腐爛級(jí)數(shù)）

失水率的測(cè)定[13]：重量法。

失水率（%）＝（貯藏前重量－貯藏后重量）/貯藏前重量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌的鑒定

從貯藏中的發(fā)霉的蜜桔上刮取菌絲，通過(guò)連續(xù)的分離純化，掃描電鏡下觀察其菌絲形態(tài)，如圖1所示。梗的頂端不膨大，但具有可繼續(xù)再分的指狀分枝，形如掃帚狀，稱為帚狀體。

每枝頂端有2～3個(gè)瓶狀細(xì)胞，其上各生一串分生孢子；分生孢子為圓形，橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征并查閱文獻(xiàn)資料鑒定其為青霉屬[14]—指狀青霉（Penicillium digitatum）。

圖1 腐敗菌的電鏡形態(tài)觀察（70×）Fig.1 Electron microscopy morphology of corrupt bacteria（70×）

2.2 芥末對(duì)蜜桔采后腐敗菌的抑制作用

2.2.1 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 芥末油處理后的菌株在26℃恒溫箱中的培養(yǎng)情況見(jiàn)表1。根據(jù)菌絲的生長(zhǎng)情況確定最低抑菌濃度及最低殺菌濃度。

前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)表明，采用0.025、0.050、0.075、0.100、0.125五種芥末油濃度進(jìn)行腐敗菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。由表1中可以看到，經(jīng)過(guò)48h的培養(yǎng)，含芥末油的培養(yǎng)基均無(wú)菌落生長(zhǎng)，可以得出芥末精油殼聚糖復(fù)配液對(duì)青霉菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.025μL/mL。再進(jìn)行48h的培養(yǎng)，當(dāng)芥末油濃度為0.075μL/mL時(shí)，無(wú)菌落生長(zhǎng)，可知芥末精油殼聚糖復(fù)配液對(duì)青霉菌的最低殺菌濃度（MBC）為0.075μL/mL。

表1 不同芥末油濃度的復(fù)配液對(duì)腐敗菌的抑制效果Table 1 Inhibitory activity of different mustard oil concentration of the mixed liquid on corrupt bacteria

表2 不同芥末油濃度的復(fù)配液對(duì)霉菌的菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of different mustard oil concentration distribution of liquid on the mycelium growth of mold

2.2.2 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)活性的影響 經(jīng)以下5個(gè)不同芥末油濃度的復(fù)配液及單殼聚糖對(duì)病原菌處理后，26℃恒溫箱中培養(yǎng)。每隔2d測(cè)一次各組抑菌圈的直徑大小。其對(duì)病原菌的抑菌效果見(jiàn)表2。

通過(guò)對(duì)不同貯藏時(shí)期各組別之間的抑菌圈直徑大小進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)貯藏2d時(shí)，1.25、2.5μL/mL的芥末油復(fù)配液處理組與殼聚糖對(duì)照組相比，其抑菌效果沒(méi)有顯著性差異（p>0.05）；而5、10、30μL/mL的芥末油復(fù)配液處理組分別與殼聚糖組及低濃度的芥末油復(fù)配液處理組之間抑菌效果有差異性顯著（p<0.05）。貯藏4d，各芥末油處理組與殼聚糖對(duì)照組對(duì)病原菌的抑菌效果均有顯著性差異（p<0.05）；且在不同濃度的芥末油復(fù)配液處理組之間，10、30μL/mL分別與1.25、2.5、5μL/mL的芥末油處理組之間抑菌效果有顯著性差異（p<0.05）。而當(dāng)貯藏6d，高濃度（10、30μL/mL）的芥末油復(fù)配液處理組與2.5μL/mL沒(méi)有顯著性差異（p>0.05）。由此可分析：當(dāng)貯藏達(dá)到一定時(shí)期，芥末油對(duì)病原菌的抑菌效果并不是隨著芥末油的濃度增大而增強(qiáng)。且在不同貯藏時(shí)期，10μL/mL的芥末油處理組與30μL/mL的芥末油處理組對(duì)病原菌的抑菌效果差異均不顯著（p>0.05），這可能是由于高濃度芥末油的藥害作用所導(dǎo)致的。

2.2.3 芥末油對(duì)蜜桔貯藏保鮮效果的影響 蜜桔在室溫條件下貯藏期間，由于空氣溫度及濕度的影響，會(huì)使果實(shí)水分蒸發(fā)，使正常的代謝發(fā)生紊亂，重量下降，出現(xiàn)皺縮等現(xiàn)象。過(guò)度的水分蒸發(fā)作為一種脅迫還會(huì)刺激果蔬中乙烯和脫落酸的合成，從而加快果蔬的成熟衰老進(jìn)程，而引起果蔬抗病性降低。各組的失水率效果見(jiàn)圖2，腐爛指數(shù)見(jiàn)圖3。

從圖2中可以看出，與對(duì)照組相比，芥末油處理組的失水率比較平緩。在貯藏14d后，處理組與對(duì)照組的失水相差明顯，自然貯藏的蜜桔在第21d左右失水率高達(dá)13.24%，而芥末油濃度為80μL/mL的復(fù)合液處理組的失水率僅為3.42%。當(dāng)貯藏28d后，芥末油處理組的失水率均高于對(duì)照組，這可能是由于對(duì)照組在20℃的溫度下貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，已嚴(yán)重失水，果實(shí)外殼變硬，果實(shí)內(nèi)部水分喪失，此時(shí)已經(jīng)不能給微生物病原菌提供生長(zhǎng)環(huán)境，成一個(gè)干殼，以致果實(shí)的腐爛指數(shù)也幾乎降至為0（見(jiàn)圖3），這種情況下計(jì)算失水率已經(jīng)沒(méi)什么意義。在貯藏后的第7d觀察，芥末油處理組的腐爛指數(shù)基本都要高于對(duì)照組。這主要是因?yàn)樵谫A藏前進(jìn)行處理時(shí)，由于對(duì)處理組的表面刷涂，果實(shí)表面未及時(shí)成膜或表面生水未干，生水通過(guò)表皮滲入果實(shí)內(nèi)部，引起病菌感染，從而導(dǎo)致腐爛指數(shù)高于對(duì)照組。但在第7～14d左右期間，相對(duì)于對(duì)照組，芥末油處理組對(duì)果實(shí)的腐爛指數(shù)急劇下降。而在第14d之后，處理組的腐爛指數(shù)變化趨勢(shì)相對(duì)平穩(wěn)，基本在0.07左右。從以上兩圖可綜合分析，在20℃的貯藏條件下，芥末油殼聚糖的復(fù)配液對(duì)蜜桔進(jìn)行保鮮處理，同自然條件下貯藏相比，貯藏一個(gè)月左右，其保鮮效果明顯。若降低貯藏溫度，芥末油處理組對(duì)蜜桔的保鮮效果可能更明顯，這需要進(jìn)一步的研究。

圖2 20℃條件下不同芥末油濃度的復(fù)合液對(duì)蜜桔涂膜處理后果實(shí)失水率的影響Fig.2 The effect of different concentrations of mustard oil compound liquid treatments on the fruit water loss rate under the condition of 20℃

圖3 20℃條件下不同芥末油濃度的復(fù)合液對(duì)蜜桔處理后果實(shí)腐爛指數(shù)圖Fig.3 The effect of different mustard oil concentration of the compound fluid on fruit rot index under the condition of 20℃

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用天然植物精油芥末油的主要成分異硫氰酸烯丙酯的抗菌性，結(jié)合殼聚糖的成膜性，對(duì)蜜桔進(jìn)行涂膜保鮮處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芥末油殼聚糖的復(fù)合液對(duì)青霉菌屬—指狀青霉的抑菌效果明顯，芥末油的最低抑菌濃度為0.025μL/mL，當(dāng)芥末油濃度為0.075μL/mL時(shí)，可完全殺死青霉病原菌。

貯藏實(shí)驗(yàn)中，蜜桔在20℃的條件下貯藏，通過(guò)對(duì)蜜桔的失水率及腐爛指數(shù)進(jìn)行綜合分析，得出當(dāng)芥末油濃度為40～80μL/mL時(shí)的復(fù)合液對(duì)蜜桔處理可以達(dá)到有效的保鮮效果，其失水變化趨勢(shì)線較平緩，失水率較小，腐爛指數(shù)也較低，約0.07左右。但芥末油的濃度越高，其對(duì)蜜桔的保鮮效果反而不好，這可能由于高芥末油濃度的毒害作用所影響。綜上分析，對(duì)于蜜桔貯藏保鮮，芥末油濃度為40～80μL/mL是比較理想的抑菌濃度范圍，即可達(dá)到一定的抑菌效果，在失水及腐爛指數(shù)兩方面分析，貯藏效果也很明顯，且其濃度范圍在感官上均為人體所接受。這也為下一步的蜜桔貯藏保鮮及各生理指標(biāo)測(cè)定提供有利的參考依據(jù)。但實(shí)驗(yàn)仍有一些問(wèn)題有待解決，如芥末精油能抑菌而又不會(huì)影響水果的品質(zhì)特性的確切濃度；高濃度芥末精油的毒害作用研究；對(duì)于芥末精油對(duì)蜜桔的保鮮處理，可以有哪些處理方式，這些都將是下一步需深入研究的方向。

[1]鄧麗莉，黃艷，周玉翔，等.殼寡糖處理對(duì)柑桔果實(shí)貯藏品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：287-290.

[2]林玲，陳金印.殼聚糖處理對(duì)“楊?。?，6”南豐蜜桔果實(shí)采后生理及貯藏效果的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：45-50.

[3]上官新晨，肖錫湘，蔣艷，等.殼聚糖涂膜保鮮金柑的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（4）：155-158.

[4]翟建華，王蓓，劉向欣，等.異硫氰酸烯丙酯的常用制法及其主要功效[J].中國(guó)調(diào)味品，2008（4）：21-24.

[5]張娜，關(guān)文強(qiáng)，李春媛.芥末精油對(duì)果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J].保鮮研究，2008，8（6）：39-41.

[6]袁萍，王國(guó)亮，龔復(fù)，等.3種植物精油對(duì)霉菌的抑制作用[J].武漢植物學(xué)研究，2001，19（6）：521-523.

[7]Wenxuan Chen，Tony Z Jin，Joshua B Gurtler.Inactivation of Salmonella on whole cantaloupe by application of an antimicrobial coating containing chitosan and allyl isothiocyanate[J].International Journal of Food Microbiology，2012，155：165-177.

[8]D Nadarajah，J H Han，R A Holley.Use of mustard flour to inactivate Escherichia coli O157∶H7 in ground beef under nitrogen flushed packaging[J].International Journal of Food Microbiology，2005，99：257-267.

[9]Pedro A Chacon，Roberto A Buffo，Richard A Holley.Inhibitory effects of microencapsulated allyl isothiocyanate（AIT） against Escherichia coli O157∶H7 in refrigerated，nitrogen packed，finely chopped beef[J].International Journal of Food Microbiology，2006，107：231-237.

[10]曾榮，張阿珊，陳金印，等.CMC與抑菌草制劑復(fù)合涂膜對(duì)冷藏南豐蜜桔的保鮮效果[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2012，28（12）：281-287.

[11]王紅星，張椎，陳美環(huán)，等.芳香型植物精油抑菌效果的測(cè)定和比較[J].中國(guó)飼料，1996（6）：32-34.

[12]張娜，關(guān)文強(qiáng)，閻瑞香，等.芥末精油對(duì)芒果采后病原真菌抑制效果和保鮮效應(yīng)的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（3）：349-353.

[13]解淑慧，王維琴，葉衛(wèi)東，等.納米TiO2-殼聚糖復(fù)合涂膜對(duì)砂糖橘的保鮮效果[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（4）：219-223.

[14]王祥紅.青霉菌的分離及其形態(tài)觀察[J].生物學(xué)通報(bào).2008，43（12）：45-46.