張 宇，鄔應(yīng)龍，黃祎萌

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

豬骨素是以天然豬骨抽提物為原料制備的膏狀物，呈淺褐色或褐色，是一種優(yōu)質(zhì)廉價(jià)豐富的天然資源，含有大量的膠原、骨膠原和軟骨素，其中的骨膠原蛋白分子形成一種十分穩(wěn)定的三股超螺旋結(jié)構(gòu)，不易被人體消化吸收[1]，并且沒(méi)經(jīng)處理的豬骨素帶有腥味，一般需進(jìn)一步加工以促進(jìn)原料分解和提高鮮味。馬國(guó)霞等[2]采用紅曲霉發(fā)酵豬骨素得到最小分子質(zhì)量為8.1ku的多肽，左勇等[3]利用乳桿菌發(fā)酵骨素酶解液進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)的降解，忻欣等[4]采用酶解和發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)提高了羊骨中鈣的轉(zhuǎn)化率等?？傮w上講，關(guān)于骨素發(fā)酵的報(bào)道多集中于液態(tài)發(fā)酵，而對(duì)微生物固態(tài)發(fā)酵骨素的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在前期已優(yōu)化了發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，以豬骨素為主要原料，分別利用紅曲菌單菌固態(tài)發(fā)酵和紅曲菌-米曲菌雙菌固態(tài)發(fā)酵，對(duì)兩種發(fā)酵過(guò)程中的蛋白酶活力、淀粉酶活力、木聚糖酶活力、氨基酸態(tài)氮、還原糖和紅色指數(shù)的變化進(jìn)行研究，并通過(guò)SDS-PAGE電泳分析兩種發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解情況，以期為豬骨素固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲菌、米曲菌 均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；豬骨素（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)45.7%） 樂(lè)山天添天然調(diào)味料食品有限公司提供；麥麩（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.4%）

購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；燕麥木聚糖 美國(guó)Sigma公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（116～14.4ku） 碧云天生物技術(shù)研究所；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 武漢博士德生物公司；可溶性淀粉、干酪素、磷酸氫二鈉、檸檬酸均為國(guó)產(chǎn)分析純；種子培養(yǎng)基 200g馬鈴薯切成小塊，加適量水煮沸20min，紗布過(guò)濾后加入20g葡萄糖，水定容至1000mL，分裝于300mL三角瓶中，120mL/瓶；豬骨素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取10g麥麩置于300mL三角瓶中，豬骨素8g，水8mL，pH調(diào)至5.5，用玻璃棒將發(fā)酵底物攪拌均勻。

DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；UV-3200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 四川新科儀器有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Mini-protean垂直電泳儀、GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬骨素固態(tài)發(fā)酵 將在斜面上培養(yǎng)6d的紅曲菌和3d的米曲菌分別制成約107個(gè)/mL的孢子懸浮液，分別取1mL接種于種子培養(yǎng)基中，于30℃、120r/min搖床分別培養(yǎng)5、2d，得到種子培養(yǎng)液。豬骨素紅曲菌發(fā)酵：取1mL紅曲菌種子培養(yǎng)液接種于豬骨素固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)40d；豬骨素雙菌發(fā)酵：對(duì)雙菌發(fā)酵的蛋白酶活力、色澤、呈味綜合考量后確定雙菌發(fā)酵工藝為紅曲菌于28℃恒溫培養(yǎng)10d后，再接種米曲菌繼續(xù)培養(yǎng)30d。

1.2.2 粗酶液和發(fā)酵液的制備 準(zhǔn)確稱取5g物料，加入20mL無(wú)菌蒸餾水，30℃、120r/min搖床提取2h，6000r/min，4℃離心20min，上層清液為粗酶液；另取5g物料于干燥箱中60℃干燥至恒重，即為物料干重；測(cè)得的酶活除以干重即為固態(tài)發(fā)酵底物的酶活，其單位為U/g干基。加入100mL無(wú)菌蒸餾水于發(fā)酵到指定時(shí)間的三角瓶中，其余與粗酶液制備方法相同，上層清液為發(fā)酵液。

1.2.3 水解酶活力測(cè)定 蛋白酶活力的測(cè)定采用福林法[5]。該紅曲菌在此發(fā)酵條件下幾乎不產(chǎn)中性和堿性蛋白酶，測(cè)定酸性蛋白酶活力。酶活力定義：在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

木聚糖酶活力的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法，參照文獻(xiàn)[6]并作適當(dāng)修改：采用0.1mol/L pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋粗酶液和配制木聚糖溶液，40℃水浴反應(yīng)20min。酶活力定義：在上述條件下，每20min水解木聚糖形成1μmol還原糖（以木糖計(jì)）作為1個(gè)木聚糖酶活力單位。

淀粉酶活力的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法，參照文獻(xiàn)[7]并作適當(dāng)修改：采用0.1mol/L pH5.5的檸檬酸緩沖液稀釋粗酶液和配制淀粉溶液，45℃水浴反應(yīng)10min。酶活力定義：在上述條件下，每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1μmol葡萄糖作為1個(gè)淀粉酶活力單位。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮測(cè)定 氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用甲醛值法[8]。

1.2.5 還原糖測(cè)定 還原糖測(cè)定按照Miller的方法[9]。

1.2.6 紅色指數(shù)的測(cè)定 參照李丹等[10]的方法。

1.2.7 蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析方法凝膠濃度分別為濃縮膠5%，分離膠15%，膠的制備方法參照文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行。發(fā)酵液用無(wú)菌水稀釋一倍，稀釋液與5×上樣緩沖液以4∶1的體積比混合，樣品上樣量均為15μL；電泳初始電壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至110V直至電泳結(jié)束，40℃染色2h后再脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中水解酶活力的變化

圖1 紅曲菌發(fā)酵豬骨素過(guò)程中水解酶活力變化Fig.1 Change of hydrolase activity during pig bone extract fermentation by Monascus

由圖1可知，紅曲菌水解酶活力在發(fā)酵4d后增長(zhǎng)較快，蛋白酶活力、淀粉酶活力、木聚糖酶活力分別在第6、10、5d達(dá)到峰值，隨后酶活力下降到一定程度后呈相對(duì)平穩(wěn)的走勢(shì)，其中蛋白酶活力下降幅度最大，在第30d以后，基本檢測(cè)不出。三種水解酶活力在發(fā)酵過(guò)程中均逐漸增加到峰值后下降，可能是由于發(fā)酵初期紅曲菌大量生長(zhǎng)繁殖，在此過(guò)程中需大量利用碳源和氮源，促進(jìn)水解酶的分泌，隨著體系中水分的降低、可直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少、pH的變化等原因，微生物的生長(zhǎng)代謝受到抑制，導(dǎo)致水解酶活力下降。

圖2 雙菌發(fā)酵豬骨素過(guò)程中水解酶活力變化Fig.2 Change of hydrolase activity during pig bone extract fermentation by double strains

如圖2所示，在第10d接種米曲菌后，中性蛋白酶活力、堿性蛋白酶活力、木聚糖酶活力開(kāi)始快速升高，分別在第35、35、25d達(dá)到峰值，隨后有下降的幅度，且中性蛋白酶和堿性蛋白酶變化趨勢(shì)基本相同；酸性蛋白酶活力、淀粉酶活力總體變化幅度不大。

結(jié)合圖1和圖2可知，紅曲菌產(chǎn)酸性蛋白酶和木聚糖酶能力較弱，在發(fā)酵后期蛋白酶活力下降幅度較快，不利于原料的降解，但紅曲菌在發(fā)酵過(guò)程中可分泌出紅曲色素及活性物質(zhì)，可改善色澤[13]。紅曲菌發(fā)酵10d后接種米曲菌的雙菌發(fā)酵，中性、堿性蛋白酶、木聚糖酶活力增加，說(shuō)明雙菌發(fā)酵可改善酶系組成，與張艷芳等[14]利用米曲霉雙菌株組合發(fā)酵得出的結(jié)論相同。

表1 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮和還原糖的變化（g/100mL）Table 1 Change of Amino acid nitrogen and reducing sugar during pig bone extract fermentation（g/100mL）

2.2 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物水解性能的變化

2.2.1 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮和還原糖的變化 體系中化學(xué)組分的變化與酶的作用密不可分[15]，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶將蛋白質(zhì)、淀粉、木聚糖降解。由表1可以看出，紅曲菌單菌和雙菌發(fā)酵豬骨素過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，雙菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶酶系多樣，紅曲霉的酸性蛋白酶和米曲霉的中性、堿性蛋白酶相輔相成，豐富了酶切方式，水解充分，雙菌發(fā)酵的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于紅曲菌發(fā)酵；還原糖量均表現(xiàn)為接種微生物后先增加后逐漸降低，在第20d以后，雙菌發(fā)酵的還原糖量少于單菌發(fā)酵，主要原因是米曲菌大量生長(zhǎng)繁殖，以及還原糖與體系中其他降解產(chǎn)物的相互作用，需消耗大量還原糖，此階段總糖的水解補(bǔ)給不足以滿足體系所需。

2.2.2 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中紅色指數(shù)的變化 由圖3可看出，雙菌發(fā)酵既發(fā)揮了紅曲菌產(chǎn)紅曲紅色素的優(yōu)勢(shì)，而且接種米曲菌后，隨著蛋白酶活力和木聚糖酶活力的不斷提高，蛋白質(zhì)原料、淀粉質(zhì)原料不斷被降解成氨基酸、還原糖類物質(zhì)，在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)等，形成棕紅色物質(zhì)，使紅色指數(shù)繼續(xù)增加。與單菌相比，雙菌發(fā)酵可提高發(fā)酵液的紅潤(rùn)度。

圖3 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中紅色指數(shù)的變化Fig.3 Change of red index during pig bone extract fermentation

2.2.3 豬骨素發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的SDSPAGE電泳分析結(jié)果 由圖4可看出，紅曲菌降解豬骨素的程度不高，其分子質(zhì)量主要在116～45ku之間，且整個(gè)電泳圖泳道顏色較深，說(shuō)明樣品中蛋白質(zhì)濃度較高，蛋白質(zhì)降解成多肽、寡肽或者氨基酸的程度不夠。

圖4 紅曲菌發(fā)酵豬骨素過(guò)程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electropherograms during pig bone extract fermentation by Monascus

圖5 雙菌發(fā)酵豬骨素過(guò)程中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electropherograms during pig bone extract fermentation by mixed strains

由圖5可看出，紅曲菌發(fā)酵10d后接種米曲菌的雙菌發(fā)酵，從第10d到第15d，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布有明顯的變化，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，可看到的蛋白質(zhì)條帶主要集中在116～25ku之間，在25ku以下，可看到五條顏色較淺的蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明大分子蛋白質(zhì)不斷被降解成了小分子蛋白質(zhì)。

結(jié)合圖4、圖5可知，紅曲菌單菌發(fā)酵蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在116～45ku，雙菌發(fā)酵蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要集中在116～25ku，雙菌發(fā)酵的分子質(zhì)量分布范圍較寬，可看到的蛋白質(zhì)條帶較多，且條帶更為清晰，泳道基本無(wú)背景色干擾，說(shuō)明雙菌發(fā)酵過(guò)程中，大分子蛋白質(zhì)被大量的降解成了小分子蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸，雙菌發(fā)酵更有利于蛋白質(zhì)的降解。

3 結(jié)論

3.1 紅曲菌水解酶活力達(dá)到峰值后，均呈下降的走勢(shì)，且蛋白酶活力下降幅度最快；雙菌組合發(fā)酵，在接種米曲菌后，中性、堿性蛋白酶活力和木聚糖酶活力快速上升，而產(chǎn)酸性蛋白酶和淀粉酶能力與紅曲菌發(fā)酵過(guò)程接近。

3.2 在發(fā)酵過(guò)程中，接種米曲菌后的雙菌發(fā)酵，其氨基酸態(tài)氮明顯高于紅曲菌發(fā)酵，且雙菌發(fā)酵可發(fā)揮紅曲菌產(chǎn)紅曲紅色素的優(yōu)勢(shì)，提高發(fā)酵液的紅潤(rùn)度，還原糖量均表現(xiàn)為先增加后逐漸降低，通過(guò)SDSPAGE電泳分析，與紅曲菌單菌發(fā)酵相比較，雙菌發(fā)酵的多肽條帶較多，分子質(zhì)量分布范圍較寬，且條帶清晰，說(shuō)明雙菌發(fā)酵更有利于蛋白質(zhì)的降解。

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