李玲玲，仇厚援，陳文學(xué)，麥力文

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

醬腌菜營(yíng)養(yǎng)豐富，為多種微生物的生長(zhǎng)提供了良好環(huán)境。醬腌菜在開蓋后和長(zhǎng)期貯藏過程中都容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，影響其腐敗變質(zhì)的主要微生物是細(xì)菌、酵母菌和霉菌，這些微生物的大量生長(zhǎng)繁殖造成了醬腌菜的霉變、腐敗[1-2]。Meldrum等發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他醬類調(diào)味品，辣椒醬更容易受到微生物的污染[3]。微生物污染是造成食品腐敗或是食源性疾病的一個(gè)重要因素[4]，因?yàn)槲⑸锏拇罅糠敝砙5]和部分霉菌代謝產(chǎn)物的積累[6]嚴(yán)重影響了食品的保藏期和安全性。因此需要添加適量的防腐劑來抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到延長(zhǎng)食品貨架期的效果。相對(duì)于天然防腐劑與生物防腐劑來講，化學(xué)合成防腐劑具有價(jià)格低廉、種類繁多、作用明顯等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。目前我國(guó)允許在醬腌菜中添加使用的防腐劑主要有苯甲酸鈉[9]、山梨酸鉀[10]、脫氫醋酸鈉[11]、尼泊金復(fù)合酯鈉[12]等幾種。這些防腐劑對(duì)每種菌的防腐效果都不相同，因此將幾種防腐劑合理的復(fù)配使用，通常比單獨(dú)使用效果更佳[13-14]。張顯久[15]和楊楠[16]也都曾做過防腐劑復(fù)配添加的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于延長(zhǎng)保藏期的效果均比較明顯。

因此需開發(fā)一種高效、安全的復(fù)配型防腐劑來應(yīng)對(duì)黃燈籠辣椒醬易腐敗變質(zhì)的問題。本實(shí)驗(yàn)所采用的供試菌為從黃燈籠辣椒醬中分離純化出的20種腐敗菌，分別測(cè)定4種常用防腐劑對(duì)此20種菌的最低抑菌濃度（MIC）和實(shí)驗(yàn)菌的抑菌直徑，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出黃燈籠辣椒醬防腐劑復(fù)配配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用菌株 均是從不含防腐劑的腐敗變質(zhì)的黃燈籠辣椒醬中分離純化所得，共20種，其中細(xì)菌11種（A1-A11，A11在初分離時(shí)的數(shù)量最多）、酵母菌1種（B1）、霉菌8種（C1-C8，C8在初分離時(shí)數(shù)量最多，但同梯度濃度下的數(shù)量小于A11）；苯甲酸鈉（安息香酸鈉） 食品級(jí)，天津東大化工有限公司；山梨酸鉀 食品級(jí)，王龍集體有限公司；脫氫醋酸鈉（脫氫乙酸鈉） 食品級(jí)，廣州市安心生物制品有限公司；尼泊金復(fù)合酯鈉（對(duì)羥基苯甲酸復(fù)合酯鈉） 食品級(jí)，無錫江大百泰科技有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅培養(yǎng)基） 購(gòu)買于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

PL3002型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BCD-232YMB型容聲冰箱 海信容聲（廣東）冰箱有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科儀器有限公司；HWS-430型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；MPL-HWS型恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；GI540W型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的制備

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂18g，加蒸餾水1000mL，調(diào)制pH7.3±1，121℃滅菌20min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）的配制參照沈萍[17]的方法；各菌所用培養(yǎng)基培養(yǎng)條件見表1。

表1 微生物的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and culture conditions of different microorganisms

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 防腐劑母液的配制及其倍比稀釋 根據(jù)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760-2011[18]中的規(guī)定，在腌漬蔬菜中，防腐劑單獨(dú)使用時(shí)最大使用量為：苯甲酸及其鹽類≤1g/kg，山梨酸鉀及其鉀鹽≤0.5g/kg，脫氫醋酸鈉≤0.3g/kg，尼泊金酯及其鈉鹽≤0.25g/kg。稱取定量的防腐劑粉末，溶解于無菌水中，按二倍稀釋法配制實(shí)驗(yàn)防腐劑的6個(gè)濃度，防腐劑的濃度梯度見表2。

1.3.2 菌懸液的制備 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010[19]中菌落總數(shù)的測(cè)定方并稍作修改，將細(xì)菌、酵母菌、霉菌分別接種于各自的選擇培養(yǎng)基上按相應(yīng)條件培養(yǎng)，待培養(yǎng)完成后，用接種環(huán)挑取單菌落于100mL無菌水中，振蕩10min，再取100μL該菌液涂布于各培養(yǎng)基平板上，分別培養(yǎng)24、48、72h后計(jì)數(shù)，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010[19]中計(jì)算公式計(jì)算出所配菌懸液的活菌濃度，所得菌懸液濃度用無菌水調(diào)配至105CFU/mL，于4℃冰箱中保存。

表2 防腐劑的濃度梯度Table 2 The concentration gradient of preservatives

1.3.3 測(cè)定方法

1.3.3.1 MIC的測(cè)定 參照沈萍等[17]的方法并稍作修改。即在無菌條件下，將各防腐劑按表2所示的濃度分別添加于各培養(yǎng)基平板中，待培養(yǎng)基凝固后加入濃度為105CFU/mL的菌懸液，均勻涂布后恒溫培養(yǎng)并觀察。以不添加防腐劑只添加菌懸液為空白對(duì)照，以培養(yǎng)基平板上完全無菌生長(zhǎng)時(shí)的防腐劑濃度為MIC。

1.3.3.2 抑菌圈直徑的測(cè)定 采用6mm濾紙片法[17]，將滅菌后的濾紙片在相應(yīng)的防腐劑溶液中浸泡30min后取出，貼于已均勻涂布實(shí)驗(yàn)菌的培養(yǎng)基平板上，每皿等距離貼三個(gè)平行的防腐劑濾紙片和一個(gè)空白對(duì)照，測(cè)定經(jīng)培養(yǎng)后的抑菌圈直徑（抑菌直徑=防腐劑抑菌直徑－空白對(duì)照抑菌直徑）。

1.3.4 防腐劑復(fù)配添加量的確定 結(jié)合各腐敗菌的MIC及從腐敗變質(zhì)的黃燈籠辣椒醬中分離時(shí)的菌落個(gè)數(shù)，選取生長(zhǎng)繁殖能力較強(qiáng)、對(duì)防腐劑較為遲鈍、含量較多的腐敗菌作為復(fù)配防腐劑的實(shí)驗(yàn)菌種。

從MIC結(jié)果中選擇4種防腐劑的合適的濃度范圍設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，其中復(fù)配防腐劑的添加比例符合《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760-2007附錄A.2的規(guī)定[18]。以4種防腐劑為因素，以實(shí)驗(yàn)菌的抑菌直徑為考察指標(biāo)，建立L16（45）正交實(shí)驗(yàn)，確定黃燈籠辣椒醬防腐劑的復(fù)配配方，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表（mg/mL）Table 3The factors and levels of orthogonal experiment（mg/mL）

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC測(cè)定結(jié)果

四種常用防腐劑對(duì)黃燈籠辣椒醬腐敗菌的抑菌效果和其差異顯著性的結(jié)果如表4所示。

由表4可知，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉、尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)供試腐敗菌的抑菌效果不同。對(duì)于4種防腐劑的MIC分別分析其差異顯著性可知，苯甲酸鈉對(duì)A10、C5和C6三種菌的抑制作用最強(qiáng)，其MIC均為0.125mg/mL；山梨酸鉀對(duì)C4和C6兩種菌的抑制作用最強(qiáng)，其MIC均為0.0625mg/mL；脫氫醋酸鈉對(duì)A1、A3、A5、A6、A7、A8、A9、A10、C6九種菌的抑制作用較強(qiáng)，其MIC均為0.075mg/mL；尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)A6、A7、B1、C1、C4、C6六種菌的抑制作用較強(qiáng)，其MIC均為0.0625mg/mL。

表4 不同防腐劑對(duì)腐敗菌的MIC（mg/mL）Table 4 MIC’s of different preservatives against three typical spoilage bacteria（mg/mL）

綜合分析四種防腐劑MIC的差異顯著性可知，四種防腐劑對(duì)A11和C8的MIC最大，其MIC分別為0.05、0.05、0.3、0.25mg/mL，故A11、C8兩種菌對(duì)四種防腐劑的抗性最強(qiáng)。因此，選定A11、C8這兩種菌為防腐劑復(fù)配實(shí)驗(yàn)菌。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以A11和C8兩種菌為實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行防腐劑復(fù)配實(shí)驗(yàn)，以抑菌直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of orthogonal experiment

由表5和表6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和極、方差分析結(jié)果可知：四個(gè)因素對(duì)細(xì)菌11號(hào)（A11）抑制效果的主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，且四種防腐劑對(duì)結(jié)果影響不顯著，極差分析得到最佳水平組合為A1B1C2D1，即添加復(fù)合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復(fù)合酯鈉濃度為0.06mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)菌11號(hào)的抑制效果最好；四個(gè)因素對(duì)霉菌8號(hào)（C8）抑制效果的主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，且僅苯甲酸鈉對(duì)結(jié)果影響顯著，極差分析得到最佳水平組合為A1B2C3D2，即添加復(fù)合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.08mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.024mg/mL，尼泊金復(fù)合酯鈉濃度為0.04mg/mL時(shí)對(duì)霉菌8號(hào)的抑制效果最好。

表6 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 6 The variance analysis of orthogonal design（random model）

實(shí)驗(yàn)菌A11對(duì)應(yīng)的防腐劑復(fù)配組合為A1B1C2D1，實(shí)驗(yàn)菌C8對(duì)應(yīng)的防腐劑復(fù)配組合為A1B2C3D2，為使兩種菌都能較好的被防腐劑抑制，應(yīng)選擇較高濃度的防腐劑復(fù)配組合作為最終防腐劑復(fù)配組合，故選定A11所對(duì)應(yīng)的防腐劑復(fù)配組合A1B1C2D1為實(shí)驗(yàn)最佳配方，即添加復(fù)合防腐劑中苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復(fù)合酯鈉濃度為0.06mg/mL。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其對(duì)A11的抑菌圈直徑為6.83mm，為最佳優(yōu)化方案。

3 結(jié)論與討論

從本實(shí)驗(yàn)可知，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉和尼泊金復(fù)合酯鈉4種化學(xué)合成類防腐劑對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌的抑制作用明顯，本實(shí)驗(yàn)最終篩選出的兩種菌分別為細(xì)菌和霉菌，與這一情況相似的是張顯久等[15]的研究，他對(duì)從開蓋后的辣椒醬中分離出的三株細(xì)菌、三株霉菌進(jìn)行了有效的抑菌實(shí)驗(yàn)，即添加了0.05%防腐劑的辣椒醬在開蓋后室溫下放置了25d才開始發(fā)霉。另外楊楠等[16]對(duì)三種防腐劑的復(fù)配實(shí)驗(yàn)也達(dá)到了延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的效果，因此本研究所得的防腐劑復(fù)配配方用于黃燈籠辣椒醬中時(shí)應(yīng)該也能延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。

四種防腐劑對(duì)20種供試腐敗菌均有抑制作用，但是其抑菌效果不同。通過對(duì)其MIC結(jié)果的差異顯著性分析，可知A11和C8兩種菌對(duì)實(shí)驗(yàn)所用四種防腐劑的抗性較強(qiáng)。通過正交優(yōu)化得出黃燈籠辣椒醬復(fù)配防腐劑的配方為：苯甲酸鈉濃度為0.24mg/mL，山梨酸鉀濃度為0.12mg/mL，脫氫醋酸鈉濃度為0.048mg/mL，尼泊金復(fù)合酯鈉濃度為0.06mg/mL，此最佳配方下測(cè)得A11的抑菌圈直徑為6.83mm。

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