劉 睿，朱蘊(yùn)菡，賈夢(mèng)蛟，王令充，王欣之，吳 皓，*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210023）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），真瓣鰓目（Eulamellibranchia）蛤蜊科（Mactridae），是一種廣泛分布于我國南北各海區(qū)的較大型低值經(jīng)濟(jì)貝類，江蘇省為四角蛤蜊的優(yōu)勢產(chǎn)地。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為四角蛤蜊可藥用，明李時(shí)珍《本草綱目》記載：蛤蜊肉“止消渴，開胃，治老癖，能為寒熱及婦人血塊”。研究表明，四角蛤蜊具有調(diào)節(jié)免疫、輔助降血糖、抗氧化等功效[1-3]。

本課題組基于全值化綜合利用的研發(fā)理念，將四角蛤蜊加工過程中的廢棄肉渣進(jìn)行酶解制備活性肽。與化學(xué)藥物相比，活性肽具有生物活性高、毒副作用小等優(yōu)勢，而海洋生物活性肽，因其來源廣泛，資源充足，受到越來越多科研工作者的關(guān)注。前期研究表明四角蛤蜊肉渣酶活性肽具有抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）等作用[4]，本文進(jìn)一步優(yōu)化四角蛤蜊酶解活性肽的制備工藝，為進(jìn)一步開發(fā)低值貝類相關(guān)功能產(chǎn)品奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，為食品或功能產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生廢棄物的綜合開發(fā)利用提出研究方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四角蛤蜊樣品為三齡貝 貝重（30±10）g，由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所于啟東市呂四港鎮(zhèn)袁灶水產(chǎn)養(yǎng)殖場取樣并保存，雌雄隨機(jī)，批號(hào)：20100103，經(jīng)江蘇省海洋水產(chǎn)研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科動(dòng)物四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve）；四角蛤蜊肉渣 實(shí)驗(yàn)室提供；胰蛋白酶（50000U/g） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ACE（從兔肺提取）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL） 美國Sigma-Aldrich公司；馬尿酸 中國藥品生物制品檢定所；乙腈 美國Tedia公司；三氟乙酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BP 211D電子天平 德國Sartorious公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；3-16PK高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；RotavaporR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司；pHs-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Unique-s15超純水儀 廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Xbridge-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm） 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四角蛤蜊肉渣酶解肽的制備 將四角蛤蜊軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次45min，瀝干。取水煎后瀝干水的四角蛤蜊肉渣稱重，加3倍量水勻漿，胰蛋白酶在45℃，pH8.5，加酶量0.25%酶解2h。酶解結(jié)束后于沸水浴滅活15min，然后于10000r/min，4℃離心20min，取上清液進(jìn)行超濾，截留分子量為50ku以下的超濾液為酶解肽。

1.2.2 ACE抑制率的測定 參照文獻(xiàn)[5]，取樣品凍干粉適量溶于0.1mol/L硼酸緩沖液（含0.3mol/L NaCl，pH8.3）制成相應(yīng)的樣品液。ACE、HHL分別用0.1mol/L硼酸緩沖液（含0.3mol/L NaCl，pH8.3）配成100mU/mL ACE溶液和5mmol/L HHL溶液。將30μL HHL和10μL樣品（或緩沖溶液）混勻后，于37℃保溫5min，再加入20μL的ACE啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后繼續(xù)于37℃下反應(yīng)1h，迅速加入70μL HCl（1mol/L）終止反應(yīng)，用高效液相色譜分析結(jié)果。同時(shí)用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對(duì)照。

色譜條件：Xbridge-C18柱（4.6mm×250mm，5μm，美國Waters公司）；流動(dòng)相：A為0.05%三氟乙酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫條件：0～40min，B流動(dòng)相10%～60%，流速：0.8mL/min；檢測波長：228nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

ACE抑制率（%）=[1-（Ai/Aj）]×100

式中：Ai為樣品組馬尿酸峰面積，Aj為空白組的馬尿酸峰面積。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇胰蛋白酶酶解，酶解過程中比較酶解溫度、酶解pH、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制肽制備的影響。以產(chǎn)物對(duì)ACE抑制率為指標(biāo)，篩選酶解工藝條件。

1.2.3.1 溫度的影響 在加酶量0.25%，pH8.5，酶解時(shí)間2h的條件下，實(shí)驗(yàn)分別考察了40、45、50、55、60℃制備酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.2 酶解pH的影響 在酶解溫度45℃，加酶量0.25%，酶解2h條件下，分別考察的pH為7.0、7.5、8.0、8.5和9.0時(shí)，所得酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.3 加酶量的影響 在pH為8.5，溫度45℃，酶解2h條件下，分別考察按加酶量占肉渣重量的百分比計(jì)分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%和0.75%時(shí)，所得酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.4 酶解時(shí)間的影響 在pH為8.5，溫度45℃，加酶量0.5%條件下，考察酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響實(shí)驗(yàn)，分別考察1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h酶解得到的四角蛤蜊酶解物的ACE抑制活性。

1.2.4 響應(yīng)面分析法研究胰蛋白酶酶解工藝 參照文獻(xiàn)[6]，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以ACE抑制率為響應(yīng)值，選擇酶解溫度（A）、加酶量（B）和pH（C）三個(gè)因素，對(duì)工藝條件使用中心點(diǎn)對(duì)稱（Central Composite）的響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of factors and levels of response surface method

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 溫度的影響 ACE抑制活性與酶解程度密切相關(guān)，不同酶解工藝會(huì)影響酶解肽的活性。其中體系溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素之一，溫度的高低直接影響著蛋白酶的穩(wěn)定性與反應(yīng)活性，而當(dāng)反應(yīng)溫度過高，可能會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，使得酶活力明顯降低。從圖1中可看出，當(dāng)溫度在45℃時(shí)，ACE抑制率達(dá)峰值，隨著溫度升高，胰蛋白酶活力不斷降低，因此反應(yīng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，接近胰蛋白酶最適酶解溫度，依據(jù)結(jié)果選擇45℃作為進(jìn)一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

圖1 酶解溫度對(duì)酶解肽ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of various temperatures on ACE inhibitory activity

2.1.2 酶解pH的影響 不同蛋白酶的最適pH亦不同，pH的改變可使蛋白酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致活性改變；不同pH還可能改變底物解離狀態(tài)，從而影響底物與酶的結(jié)合，改變酶促反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)圖2結(jié)果分析，不同pH對(duì)酶解物的ACE抑制活性有影響，可能由于不同pH條件下，酶解程度不同使得酶解產(chǎn)物活性有差異。從圖2中可看出，pH為8.5時(shí)，ACE抑制率達(dá)峰值；當(dāng)pH達(dá)到9.0時(shí)，ACE抑制率下降。胰蛋白酶在其最適酶解pH時(shí)的酶解效果最佳，當(dāng)高于或低于最適pH時(shí)均影響酶解效果。因此選擇pH8.5作為響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

圖2 pH對(duì)酶解肽ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of enzymatic pH on ACE inhibitory activity

2.1.3 加酶量的影響 高效性是酶促反應(yīng)的特點(diǎn)之一，少量的酶即可以產(chǎn)生顯著的催化效果，從圖3中可看出，不加酶時(shí)勻漿液濾過組分的ACE抑制率僅為19.50%，而在加酶量為0.05%時(shí)酶解物的ACE抑制率即可高達(dá)64.18%；隨著加酶量的增大，酶解物的ACE抑制率逐漸增加，在加酶量增大到0.5%時(shí)，酶和底物接近最佳比例，再提高加酶量不會(huì)改變酶解反應(yīng)進(jìn)程，ACE抑制率基本維持不變。因此，選擇加酶量0.5%為響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

圖3 加酶量對(duì)酶解肽ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of various enzymatic concentrations on ACE inhibitory activity

2.1.4 酶解時(shí)間的影響 酶解過程中，酶解時(shí)間會(huì)影響酶解產(chǎn)物的水解度，從而影響酶解產(chǎn)物的生物活性，因此需確定合適的酶解時(shí)間。從圖4中可看出，隨著酶解時(shí)間延長，酶解效率提高，ACE抑制率逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間在2h時(shí)ACE抑制率處于峰值，當(dāng)時(shí)間超過2h時(shí)，ACE的抑制活性反而降低，這可能由于酶解產(chǎn)物水解度不同導(dǎo)致活性不同。結(jié)果表明，2h的酶解時(shí)間選擇為最佳。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解肽ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of various enzymatic time on ACE inhibitory activity

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制活性影響較小，選擇酶解溫度（A）、加酶量（B）和pH（C）三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。以Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，以ACE抑制活性為響應(yīng)指標(biāo)，建立數(shù)學(xué)回歸模型，對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)分析不同因素間的交互作用。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到回歸方程：Y=76.18+0.64A+3.61B－1.01C－0.61AB－0.13AC+1.68BC－0.44A2－3.20B2－1.45C2。

表2 Central composite響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Process variables and levels in central composite design arrangement and response values of ACE inhibitory activity of products

由表3方差分析可知，模型顯著（p值＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p值＞0.05），表明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾小，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起，說明模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，建立的模型能夠反映響應(yīng)值變化。酶解溫度（A）、加酶量（B）和pH（C）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均顯著（p值＜0.05）。交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2，一次項(xiàng)A對(duì)響應(yīng)值A(chǔ)CE抑制率影響顯著，一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)BC，二次項(xiàng)B2、C2對(duì)響應(yīng)值A(chǔ)CE抑制率影響極顯著，交互項(xiàng)AC對(duì)ACE抑制率的影響不顯著，表明酶解溫度（A）與加酶量（B）之間存在交互作用，達(dá)到顯著水平；加酶量（B）與pH（C）之間存在交互作用，達(dá)到極顯著水平。按照對(duì)ACE抑制活性影響大小對(duì)三個(gè)因素排序，結(jié)果為：加酶量＞pH＞溫度。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

依據(jù)建立的模型及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳酶解工藝條件為：四角蛤蜊肉渣勻漿液加入0.60%胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 8.50，在溫度48℃，酶解時(shí)間為2h。以確定的最佳工藝參數(shù)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得ACE抑制率為分別為77.98%，76.10%和77.16%，平均值為77.08%，與預(yù)測值77.22%的相對(duì)誤差為0.18%，與預(yù)測值無顯著性差異，證明響應(yīng)面法切實(shí)可行，對(duì)于酶解肽工藝優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

本文研究對(duì)象為江蘇沿海優(yōu)勢低值貝類四角蛤蜊，江蘇省每年產(chǎn)量約占全國總量的1/3，資源豐富。目前四角蛤蜊的開發(fā)仍以簡單食品加工或鮮食為主，缺少系統(tǒng)開發(fā)與綜合利用，本課題組致力于江蘇沿海低值貝類的綜合開發(fā)利用研究，充分合理開發(fā)低值貝類，以形成低值貝類全值化綜合利用的產(chǎn)業(yè)鏈，前期研究將四角蛤蜊軟體提取精制獲得四角蛤蜊多糖，用于開發(fā)具有調(diào)節(jié)免疫及輔助降血糖的功能產(chǎn)品[7]，而經(jīng)過提取的肉渣作為廢棄物丟棄不僅污染環(huán)境，且造成資源浪費(fèi)。因此，本課題對(duì)四角蛤蜊肉渣進(jìn)行酶解，充分利用四角蛤蜊資源，制備具有抗氧化、ACE抑制作用的酶解肽。

3 結(jié)論

本文用響應(yīng)面法優(yōu)化四角蛤蜊肉渣酶解工藝，建立了四角蛤蜊肉渣酶解的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。利用響應(yīng)面對(duì)酶解物制備的各因素及其交互作用進(jìn)行了分析，確定最佳工藝為：四角蛤蜊肉渣勻漿液加入0.60%胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH8.50，在溫度48℃，酶解時(shí)間為2h，在最佳工藝條件下獲得的酶解物的抑制率為77.08%，與預(yù)測值77.22%基本吻合，表明本文方法合理可行。

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