孟 翔，歐陽革成，Xia Yulu，郭明昉，*

(1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;2.廣東省科學(xué)院，廣州 510070;3.National Science Foundation Center for Integrated Pest Management，North Carolina State University，1730 Varsity Dr.Suite 110，Raleigh，NC 27606，USA)

柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama屬同翅目木虱科，是柑橘黃龍病亞洲種和美洲種唯一的傳播媒介。它取食黃龍病株后可終生帶毒，且傳毒率高［1-5］。目前我國(guó)防治柑橘木虱主要采取化學(xué)防治措施，雖然有一定的效果，但頻繁的使用農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境破壞和產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性問題不容忽視［6-7］，因此尋找新的防控方法與途徑是一項(xiàng)迫切的任務(wù)。

目前，天敵群落在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的地位越來越突出，利用天敵防治害蟲已成為熱點(diǎn)。其中節(jié)肢動(dòng)物捕食者被認(rèn)為是一種控制害蟲種群增長(zhǎng)的重要因子［8］。捕食性天敵的利用是有害生物可持續(xù)控制的重要方法之一。在諸多研究捕食性天敵對(duì)害蟲捕食效應(yīng)的方法中，常規(guī)的室內(nèi)捕食功能測(cè)定和田間捕食效果觀察法［9］不但工作量大，操作過程繁瑣，且試驗(yàn)條件與實(shí)際生態(tài)環(huán)境存在較大差異;而以生化手段的研究方法，如:免疫標(biāo)記(ELISA)、單克隆抗體、同位素與放射性同位素標(biāo)記、蛋白質(zhì)電泳分析［10-12］等，雖然在一定程度提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，但其技術(shù)上多具有一定的局限性［13-14］，如:必要的設(shè)備分析、復(fù)雜的抗體制備、環(huán)境和安全的考慮等都限制了捕食作用評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

然而，借助分子生物學(xué)技術(shù) (如:ITS、mtDNA、SCAR和細(xì)胞色素氧化酶(COⅠ、Ⅱ)基因標(biāo)記等)檢測(cè)天敵消化道內(nèi)是否含有害蟲殘?bào)w［15-16］已經(jīng)成為探明不同生境捕食者-獵物的捕食動(dòng)態(tài)和頻率，揭示環(huán)境變化對(duì)捕食控害能力的影響及其內(nèi)在機(jī)制的主流技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)不僅大大提高了測(cè)試的敏感性，且操作簡(jiǎn)單，檢驗(yàn)迅速。因此，其已逐步發(fā)展成為昆蟲捕食效應(yīng)研究的有效方法，并被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究［16-17］。

本研究通過COⅠ標(biāo)記法設(shè)計(jì)柑橘木虱特異性片段擴(kuò)增引物，并針對(duì)與柑橘木虱同域發(fā)生的其它害蟲:紅蜘蛛、柑橘黑刺粉虱、蚜蟲、卷葉蛾、潛葉蛾等以及捕食性天敵進(jìn)行種特異性檢驗(yàn)和田間主要捕食性天敵的篩選，擬為柑橘木虱捕食性天敵譜的研究提供分子生物學(xué)依據(jù)。同時(shí)在室內(nèi)條件下研究龜紋瓢蟲成蟲取食單頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲的消化反應(yīng)，為特定捕食性天敵昆蟲捕食作用的定性與定量檢測(cè)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

柑橘木虱及田間節(jié)肢動(dòng)物均用網(wǎng)捕、手捕法采自廣東省四會(huì)市羅源鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)田，田間常規(guī)管理，期間不施用任何殺蟲劑。

供取食消化實(shí)驗(yàn)的龜紋瓢蟲于實(shí)驗(yàn)田采集后，帶回廣東省昆蟲研究所蟲鼠害生態(tài)控制研究中心養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)(溫度(25±1)℃;光周期L14∶D10;相對(duì)濕度:60%—80%)備用。

1.2 DNA的提取

DNA提取采用單頭勻漿法。參考安瑞生等的方法［18］，將單頭蟲用雙蒸水清洗、吸干裝入1.5 mL離心管，加入 50μL 提取緩沖液 A(1%SDS，50 mmol/LTris·Cl，25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA)，-20℃放置 5 min后以研磨棒搗碎，然后用100 μL提取緩沖液沖洗研磨棒;65℃水浴45 min，中間取出混勻2次;加入等體積的提取液B(3 mol/LKAC(pH值7.2))，冰上放置1 h以上;12 000 r/min離心10 min，移上清液于另一離心管中12 000 r/min離心10 min，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，放置-20℃1 h以上;12 000 r/min，離心10 min，收集沉淀，用70%乙醇洗滌1—2次;晾干沉淀;每管加入50μL 0.1×TE，充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 柑橘木虱特異引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)柑橘木虱細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因序列(GenBank:JF509109.1)應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異片段擴(kuò)增引物對(duì)A和B，引物對(duì)A:上游引物:5'-TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC-3';下游引物:5'-TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA-3'。引物對(duì)B:上游引物:5'-CCAAGGAGTAGGAACAGGCTGA-3';下游引物:5'-TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA-3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 25 μL:Taq DNA 聚合酶 0.5 μL;dNTP 2 μL;10×buffer 2.5 μL;上游引物 1 μL;下游引物 1 μL;DNA 模板 1 μL;ddH2O 17 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 Eppendorf Mastercycler ep基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行，對(duì)照反應(yīng)體系中的DNA模板以雙蒸水代替。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min;反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為:0.5×TBE(45 mmol/L Tris-硼酸鹽，1 mmol/L EDTA)，以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker作為參照物檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 引物種特異性檢驗(yàn)

以與柑橘木虱同域發(fā)生的節(jié)肢動(dòng)物(龜紋瓢蟲Propylea japonica;日本刀角瓢蟲Serangium japonicum;紅肩瓢蟲Leis imidiate;小瓢蟲亞屬 Scymnus pullus(sp);麗草蛉幼蟲 Chrysopa sinica;八斑球腹蛛 Theridion octomaculatum;大銀腹蛛Leucauge magnifica;草間小黑蛛Erigonidium graminicolum;斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus;微蟹蛛屬Lysiteles(sp);黑細(xì)長(zhǎng)蟻Teraponera nigar;舉腹蟻屬Crematogaster(sp);蚜蟲Aphidoidea sp;柑橘黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus;紅蜘蛛Tetranychus cinnbarinus;卷葉蛾Homona magnanima;稻蝗屬Oxya(sp);紅脊長(zhǎng)蝽Tropidothorax elegans;柑橘潛葉蛾P(guān)hyllocnistis citrella;螳螂科Mantidae(sp))饑餓48 h的DNA作為模板，以取食2頭柑橘木虱若蟲的龜紋瓢蟲成蟲作為陽性對(duì)照、清水作為陰性對(duì)照，分別以引物對(duì)A和B進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)COⅠ引物的種特異性，以避免在使用柑橘木虱特異性引物的PCR中出現(xiàn)假陽性。PCR反應(yīng)體系與程序同上。

1.5 田間柑橘木虱捕食性天敵檢測(cè)

于2011年10月1日至12月1日柑橘木虱盛發(fā)期每周調(diào)查1次，在樣田內(nèi)隨機(jī)采集捕食性天敵，單頭分裝，-20℃凍存待測(cè)。以引物對(duì)A檢測(cè)捕食性天敵對(duì)柑橘木虱的捕食作用。

1.6 消化時(shí)間對(duì)特異性引物檢測(cè)效果研究

以田間采集的龜紋瓢蟲成蟲為實(shí)驗(yàn)材料，龜紋瓢蟲成蟲饑餓處理48 h后，飼喂柑橘木虱4齡若蟲1頭或成蟲1頭。取食柑橘木虱后的龜紋瓢蟲置25℃恒溫下培養(yǎng)，期間只給水，不飼喂任何食物。分別在取食柑橘木虱后 0，1，3，6，12，24，48，72，96 h，單頭提取龜紋瓢蟲成蟲 DNA，用于 PCR。PCR 以引物對(duì) A 作引物，反應(yīng)體系與程序同上。實(shí)驗(yàn)每處理重復(fù)10次，最后統(tǒng)計(jì)出陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物種特異性驗(yàn)證

通過對(duì)21種節(jié)肢動(dòng)物的驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn):引物對(duì)A和B對(duì)柑橘木虱及取食2頭柑橘木虱的龜紋瓢蟲成蟲(陽性對(duì)照)均具有明顯的擴(kuò)增效果，且條帶明顯。所擴(kuò)增片段大小分別約為420 bp和322 bp。其中，引物對(duì)A對(duì)其它種類無擴(kuò)增作用，物種特異性強(qiáng)。引物對(duì)B還分別可以從數(shù)種其他節(jié)肢動(dòng)物的DNA模板中擴(kuò)增出與目標(biāo)片段相同的PCR產(chǎn)物?？梢娨飳?duì)B對(duì)柑橘木虱不具有特異性。引物對(duì)A在試驗(yàn)涉及的物種范圍內(nèi)具有對(duì)柑橘木虱的種的特異性，可用于進(jìn)一步試驗(yàn)(圖1)。

圖1 引物對(duì)A和引物對(duì)B特異性驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification of some species in citrus orchards using primers A and primers B

2.2 田間柑橘木虱捕食性天敵檢測(cè)結(jié)果

以柑橘木虱田間采集的各種捕食性天敵為對(duì)象，應(yīng)用引物對(duì)A單頭檢測(cè)其對(duì)柑橘木虱的捕食作用。結(jié)果表明(表1):在所檢測(cè)的8類群20種捕食性天敵中，瓢蟲、草蛉、食蚜蠅、獵蝽、螞蟻等天敵均具有捕食柑橘木虱的能力，其中以龜紋瓢蟲Propylea japonica、斜紋貓蛛 Oxyopes sertatus、麗草蛉Chrysopa formosa最為明顯，其陽性反應(yīng)比率分別為58.06%，57.89%和48.00%。

2.2 消化時(shí)間對(duì)特異性引物檢測(cè)效果的影響

以引物對(duì)A對(duì)龜紋瓢蟲成蟲腹內(nèi)的柑橘木虱4齡若蟲和成蟲成分分別進(jìn)行陽性檢測(cè)，結(jié)果表明(圖2):在取食后0 h處理的龜紋瓢蟲中均能檢測(cè)到柑橘木虱成分，但隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，其DNA條帶擴(kuò)增效果降低，陽性比率下降，兩者呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用Probit模型模擬龜紋瓢蟲成蟲取食柑橘木虱4齡若蟲和成蟲的陽性比率與消化時(shí)間的關(guān)系，以引物對(duì)A進(jìn)行檢測(cè)，擬合良好(Chi-Square=0.769，P=0.979;Chi-Square=0.833，P=0.975)，半衰期分別為4.93 h和12.98 h。

表1 柑橘園捕食性天敵對(duì)柑橘木虱捕食作用的COⅠ檢測(cè)Table 1 The predatory detection of predators based on COⅠgene of Diaphorina citri in citrus orchards

圖2 利用特異性引物對(duì)A檢測(cè)龜紋瓢蟲成蟲對(duì)柑橘木虱捕食的陽性檢出率與消化時(shí)間的關(guān)系Fig.2 The relations of Diaphorina citri DNA detection probability and different digestion time in Propylea japonica samples after feeding，using primers A

3 結(jié)論與討論

捕食者-獵物系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的相互作用系統(tǒng)，是群落生態(tài)學(xué)中的一個(gè)重要組成部分，也是進(jìn)行害蟲生物防治和天敵利用的重要科學(xué)依據(jù)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)為研究捕食者-獵物關(guān)系提供了更為有效、準(zhǔn)確的方法。本研究根據(jù)已知柑橘木虱COⅠ基因序列，尋找柑橘木虱不同于其他種的獨(dú)特區(qū)域。針對(duì)單一物種設(shè)計(jì)引物通常會(huì)受到相近種序列高度相似的干擾［19］。本研究不局限于分子分類學(xué)研究，而是從柑橘園本身的害蟲和天敵種群及其生態(tài)環(huán)境出發(fā)，針對(duì)與柑橘木虱同域發(fā)生的近似種及其他害蟲和天敵成功設(shè)計(jì)了柑橘木虱特異性PCR引物，并在田間天敵檢測(cè)和室內(nèi)消化檢測(cè)中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步明確和豐富了柑橘木虱的主要捕食性天敵種類，表明捕食性天敵是柑橘木虱綜合防治中值得利用的重要天敵資源?？梢娀贑OⅠ基因的分子標(biāo)記方法適合柑橘木虱捕食性天敵的篩選與捕食作用的評(píng)估。

在消化道內(nèi)含物的分子分析時(shí)，捕食者消化道中獵物殘留DNA的可檢測(cè)時(shí)間非常重要，其決定了DNA技術(shù)的實(shí)際可行性。如:鱗翅目昆蟲Eupithecia sp的卵被瓢蟲Halmus chalybeus取食后，24 h可檢測(cè)率為85%;小菜蛾P(guān)lutella xylostella在姬蝽腸道內(nèi)，16 h可檢測(cè)率為67%，在狼蛛Lycosa sp腸道內(nèi)，72 h可檢測(cè)率為80%［20-22］。本研究通過PCR陽性反應(yīng)檢測(cè)，可以追蹤到龜紋瓢蟲成蟲取食1頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲24 h的可檢測(cè)率分別為:10%和30%，其最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間分別為48 h和72 h。根據(jù)DNA可檢測(cè)的時(shí)限性，我們可以推測(cè)柑橘木虱在田間被龜紋瓢蟲捕食的時(shí)間范圍。此外，在自然生態(tài)系統(tǒng)中，由于一些捕食者食性廣泛又具有一定的選擇性，其間接捕食作用會(huì)對(duì)消化道內(nèi)含物的分子分析和評(píng)估造成一定影響。本實(shí)驗(yàn)所研究的龜紋瓢蟲屬于廣食性天敵，其在自然環(huán)境中對(duì)柑橘木虱的捕食作用與間接捕食作用的關(guān)系及其影響因素尚有待進(jìn)一步研究。

不同捕食者對(duì)同一獵物的消化能力呈較豐富的多樣性。如馬鈴薯甲蟲卵在瓢蟲腸道中的半衰期是7.0 h，在刺肩蝽中的半衰期是50.9 h［23］，而本研究結(jié)果同樣表明同一捕食者(龜紋瓢蟲成蟲)對(duì)獵物(柑橘木虱)不同蟲態(tài)的消化能力也呈較豐富的多樣性，龜紋瓢蟲成蟲分別取食1頭柑橘木虱4齡若蟲或成蟲的消化半衰期分別為4.93 h和12.98 h?？梢?，食物鏈DNA跟蹤技術(shù)可在某種程度上闡明龜紋瓢蟲在空間與時(shí)間上對(duì)柑橘木虱的捕食規(guī)律。

此外，由于昆蟲等是變溫動(dòng)物，代謝水平隨溫度升高而加速，獵物可被檢出的時(shí)間會(huì)隨溫度的升高而變短，因此獵物在天敵腸道內(nèi)滯留時(shí)間分析時(shí)，尚需考慮溫度對(duì)變溫動(dòng)物消化的影響［19］。本試驗(yàn)在室內(nèi)特定條件下進(jìn)行，捕食者和獵物均處于一個(gè)簡(jiǎn)單的封閉系統(tǒng)內(nèi)，其生存條件和自然條件存在很大差異。對(duì)生活在自然界的節(jié)肢動(dòng)物來說，其捕食作用受到各種環(huán)境因子的影響，每次的試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際情況下的捕食量、捕食后的消化速率以及捕食頻率都有一定差異。可見，節(jié)肢類捕食者捕食作用的定量評(píng)價(jià)是一件十分困難的事情。因此，柑橘木虱主要捕食性天敵對(duì)柑橘園其他昆蟲的捕食作用及生態(tài)關(guān)系還有待進(jìn)一步探索研究。

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