黃巍 唐燦 由鳳鳴

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 成都市 610074；2.西華大學(xué) 成都市 610039）

替加環(huán)素是全球首個(gè)被批準(zhǔn)的用于靜脈注射的甘氨酰環(huán)素類抗生素[1,2]，其結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類藥物相似。替加環(huán)素抗菌譜廣，對(duì)有耐藥性的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也有活性，2005年6月美國FDA批準(zhǔn)該藥應(yīng)用于成人復(fù)雜皮膚及軟組織感染和成人復(fù)雜的腹內(nèi)感染，包括闌尾炎、燒傷感染、腹內(nèi)膿腫、深部軟組織感染及潰瘍感染。

為了分析注射用替加環(huán)素的過敏性，我們采用了大鼠皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)（PCA）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS600L電子天平（上海友聲衡器有限公司）；FA1004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；722S可見分光光度計(jì)（上海梭光技術(shù)有限公司）；TDL-80-2B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

0.9 %氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：M11120411，規(guī)格：500 ml）；卵白蛋白（美國Sigma公司，批號(hào)：A-5252，規(guī)格：10 g）；注射用替加環(huán)素（四川中興藥物有限公司，批號(hào)：20111201，規(guī)格：50 mg）。伊文思藍(lán)（UNI-CHEM，批號(hào)：GD4061465）；丙酮（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20080303，規(guī)格：500 ml）；弗氏完全佐劑（sigma，批號(hào)：F5881，規(guī)格：10 ml）；弗氏不完全佐劑（sigma，批號(hào)：F5506，規(guī)格：10 ml）。

1.3 動(dòng)物

大鼠32只，體重180～220 g，雌性12只，雄性20只，均購于四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川 )2008-14。

2 方法

2.1 溶液的制備

1）抗血清藥物溶液的制備[3-5]：用0.9%氯化鈉注射液配制成濃度10 mg/ml的卵白蛋白陽性對(duì)照組溶液和1.5 mg/ml、0.5 mg/ml的替加環(huán)素高、低劑量組溶液。

2）致敏溶液的制備：分別取4組抗血清，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成1∶2、1∶4、1∶8的溶液。

3）激發(fā)溶液的制備：用0.5%伊文思藍(lán)-0.9%氯化鈉注射液配制成濃度1 mg/ml的卵白蛋白陽性對(duì)照組溶液和1.5 mg/ml、0.5 mg/ml的替加環(huán)素高、低劑量組溶液。

2.2 分組和給藥方法

1）抗血清制備分組：8只雄性大鼠分別按體重分為陰性對(duì)照組（氯化鈉注射液）、陽性對(duì)照組（卵白蛋白）和替加環(huán)素高、低劑量組，每組2只。

2）致敏和激發(fā)試驗(yàn)分組：取大鼠24只，雌雄各半，按體重分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和替加環(huán)素高、低劑量組，每組6只。

3）抗血清制備方法：陰性對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液）、陽性對(duì)照組（10 mg/ml卵白蛋白）、替加環(huán)素高劑量組（1.5 mg/ml）、替加環(huán)素低劑量組（0.5 mg/ml）4組大鼠分別腹腔注射相應(yīng)藥物1 ml/只，同時(shí)腹腔注射弗氏（完全/不完全）佐劑0.2 ml/只（首次注射使用弗氏完全佐劑，后兩次注射使用弗氏不完全佐劑），隔日注射1次，共3次。末次注射后14 d，大鼠股動(dòng)脈取血，分別收集4組的血液置于室溫下，析出血清，離心（3 000 r/min，15 min）。在無菌條件下，吸出抗血清，各組抗血清分別混勻，-20 ℃冷凍保存。

4）致敏方法：致敏前將每只大鼠背部從頭部沿尾部方向劃分為3個(gè)區(qū)域，并用記號(hào)筆畫一個(gè)直徑為2 cm的圈作為標(biāo)記，靠近頭部的區(qū)域?yàn)?∶2稀釋度區(qū)，中間的區(qū)域?yàn)?∶4稀釋度區(qū)，靠近尾部的區(qū)域?yàn)?∶8稀釋度區(qū)。各組分別于圈內(nèi)皮內(nèi)注射相應(yīng)稀釋度的抗血清0.1 ml。激發(fā)方法：致敏24 h后，陰性對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液）、陽性對(duì)照組（1 mg/ml卵白蛋白）、替加環(huán)素高劑量組（1.5 mg/ml）、替加環(huán)素低劑量組（0.5 mg/ml）4組大鼠，分別尾靜脈注射已加入伊文思藍(lán)的相應(yīng)藥物1 ml/只進(jìn)行激發(fā)。

2.3 觀察指標(biāo)

激發(fā)30 min后斷頭處死大鼠，剪取背部皮膚，分別測量皮膚內(nèi)層3個(gè)區(qū)域的藍(lán)斑大小，直徑大于5 mm者判為陽性，不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長徑與短徑之和的1/2。將各藍(lán)色斑皮片剪下，剪碎，分別加入丙酮-0.9%氯化鈉注射液（7∶3）混合液5 ml，浸泡48 h，離心（2 000 r/min，20 min），取上清液測吸光度（波長610 nm）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Fisher精確檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。P<0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果

大鼠背部皮膚3個(gè)區(qū)域（1∶2稀釋度，1∶4稀釋度，1∶8稀釋度）的藍(lán)斑觀察結(jié)果見表1。陽性對(duì)照各稀釋組大鼠藍(lán)斑直徑均為陽性（P<0.001）。注射用替加環(huán)素高、低劑量各稀釋組藍(lán)斑直徑均為陰性（P<0.001）。注射用替加環(huán)素對(duì)大鼠未產(chǎn)生被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)。

表1 大鼠皮膚藍(lán)斑觀察和吸光度測定

4 討論

按照仿制藥的注冊申報(bào)要求，注射劑應(yīng)進(jìn)行臨床前的過敏性評(píng)價(jià)研究。藥物的過敏反應(yīng)中，發(fā)生率最高的為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。豚鼠體內(nèi)補(bǔ)體非常豐富，能最直觀地反映Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，因此豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)常用于過敏性實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)研究。但是豚鼠對(duì)抗生素的敏感性比小鼠高1 000倍，對(duì)青霉素類、紅霉素類、四環(huán)素類等抗生素特別敏感[6]，無論給藥劑量多大，給藥途徑如何，均可引起豚鼠發(fā)生小腸炎或結(jié)腸炎而死亡。我們曾采用豚鼠主動(dòng)過敏試驗(yàn)評(píng)價(jià)注射用替加環(huán)素的過敏性，但注射用替加環(huán)素高、低劑量組豚鼠在致敏期間均有死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)均有腸脹氣現(xiàn)象，導(dǎo)致評(píng)價(jià)無法進(jìn)行。

本研究中被動(dòng)皮膚過敏實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用大鼠，是因?yàn)槠鋵?duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)藥物都能夠很好地耐受。實(shí)驗(yàn)方法為先在弗氏佐劑的強(qiáng)化下制備抗藥物的抗血清，然后另選動(dòng)物在皮內(nèi)注射抗血清，隨后靜脈注射藥物和染色劑，靜脈注射的藥物與皮內(nèi)預(yù)先注射的抗血清進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致皮內(nèi)染色，比較染色的強(qiáng)弱可以量化藥物與抗血清的結(jié)合程度，從而反映藥物致敏性的強(qiáng)弱。在本研究中陽性組出現(xiàn)了明顯的藍(lán)斑，而注射用替加環(huán)素高、低劑量組藍(lán)斑的直徑及吸光度與陰性組之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無顯著性，大鼠被動(dòng)皮膚過敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：注射替加環(huán)素后未呈現(xiàn)明顯的致敏性。

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