趙艷紅　李洪發(fā)　王春玲　楊強　鄭朝　付雅麗

[摘要] 目的 研究Osterix（Osx）過表達對人牙周膜細胞受力后骨向分化的影響，探討Osx與正畸牙周組織骨改建的關(guān)系。方法 采用組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細胞，用重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx轉(zhuǎn)染人牙周膜細胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot方法檢測未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染Osx組細胞Osx mRNA和蛋白表達水平；并觀察核心結(jié)合因子α1（Cbfα1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨橋素（OPN）、骨鈣素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（Col Ⅰ）的mRNA表達情況。3組細胞加載6 h離心力后，觀察上述檢測指標(biāo)的變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染24 h后，相對未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組Osx mRNA和蛋白水平無明顯變化（P>0.05）；而轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），同時5個成骨標(biāo)志基因的mRNA表達亦均明顯升高（P<0.05，P<0.01）。加力6 h后，3組Osx和成骨標(biāo)志基因表達水平均明顯升高，但是轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達增強更加顯著，增加量約為其他兩組的2倍，其ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ的mRNA表達亦升高更顯著。結(jié)論 Osx過表達可以促進人牙周膜細胞在機械力作用下向成骨樣細胞分化。Osx可能通過調(diào)控多種成骨基因的表達，從而在正畸牙周組織的骨改建過程中發(fā)揮著重要的作用。

[關(guān)鍵詞] Osterix； 過表達； 人牙周膜細胞； 機械刺激； 成骨分化

[中圖分類號] Q 78 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.021

牙周膜細胞在機械力的誘導(dǎo)下分化為成骨細胞[1]，參與骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的關(guān)鍵。牙周膜細胞通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對機械力作出反應(yīng)，引發(fā)一系列細胞生物學(xué)反應(yīng)。此過程涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近年來少數(shù)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)：一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子參與了牙周膜細胞內(nèi)調(diào)控途徑，在將細胞外物理或機械刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細胞反應(yīng)方面發(fā)揮著積極的調(diào)控作用。

Osterix（Osx）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的骨形成轉(zhuǎn)錄因子，它是成骨細胞分化和骨形成不可缺少的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化所必需的[5]。近年來少量研究[5-7]發(fā)現(xiàn)：Osx在牙胚、造釉細胞瘤牙源性組織中均有陽性表達，表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。筆者前期實驗已經(jīng)證實了在體外機械力作用下人牙周膜細胞內(nèi)Osx mRNA和蛋白的表達增強，參與細胞的成骨分化[8]。本實驗進一步開展了Osx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗及后續(xù)加載實驗，旨在檢測多種成骨標(biāo)志基因表達的變化，從而進一步明確人牙周膜細胞受力后骨向分化過程是否通過Osx信號通路，并探討Osx在此過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx（由美國Tufts大學(xué)牙科學(xué)院口腔生物研究所惠贈），質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶（Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和Xba Ⅰ）、DNA Marker

（大連寶生物工程有限公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Merck公司，德國），DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胰蛋白酶、瓊脂（Sigma公司，美國），LipofectamineTM2000

轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），Trizol（上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，美國），Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ（Roche Applied Science公司，德國），山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorid，PVDF）膜（Amersham Bio-sciences公司，瑞典）。

IXZ-ILL100型倒置相差顯微鏡、CX71顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本），CO2細胞培養(yǎng)箱、

臺式冷凍高速離心機（Heraeus公司，德國），梯度聚

合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Bio-metra公司，德國），電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、制膠器（BIO-RAD公司，美國）。

1.2 人牙周膜細胞的原代培養(yǎng)和鑒定

取11～14歲青少年因正畸而拔除的牙周健康的前磨牙。采用組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細胞，取第2代細胞爬片，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，進行來源鑒定。

1.3 人牙周膜細胞的體外轉(zhuǎn)染

1.3.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx的初步鑒定 利用限制性內(nèi)切酶對pcDNA3.1 flag-Osx進行酶切鑒定。按照試劑盒說明，分別利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ建立單酶切鑒定體系，利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ建立雙酶切鑒定體系，混勻后37 ℃水浴2～3 h。取10 μL上述酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳圖譜，最終確定是否轉(zhuǎn)化成功。

1.3.2 轉(zhuǎn)染人牙周膜細胞 取生長狀態(tài)良好的第2～3代人牙周膜細胞，按照每孔2.5×105個接種于6孔細胞培養(yǎng)板。待細胞融合至80%時，按陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作，用重組質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx和空載體質(zhì)粒pcDNA3.1 flag轉(zhuǎn)染人牙周膜細胞。轉(zhuǎn)染4～5 h后移去轉(zhuǎn)染液，加入DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、48、72 h收集細胞，檢測轉(zhuǎn)染后不同時間點Osx基因和蛋白表達情況，并選取培養(yǎng)24 h的細胞進行后續(xù)加力實驗。

1.4 人牙周膜細胞的體外加力

本研究參照以往的報道[9]，采用離心加力法對

細胞加載機械力。將分別種有無轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（pcDNA3.1 flag）、轉(zhuǎn)染目的基因（pcDNA3.1 flag-

Osx）3組細胞的6孔板在無菌條件下用無菌密封膠密封，置于37 ℃離心機加力支架中，以離心機加力（631 r·min-1，約80 g相對離心力）6 h。此加力方式相當(dāng)于對人牙周膜細胞施加接近正畸臨床的持續(xù)壓力，大小約為16 g·cm-2，屬于正畸臨床輕力范圍[8]。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-poly-

merase chain reaction，RT-PCR）

采用Trizol法提取細胞總RNA，并進行質(zhì)量測定。應(yīng)用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒建立反應(yīng)體系，離心混勻后置于循環(huán)變溫加熱器進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。生成的cDNA置冰上進行后續(xù)實驗或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取2 μL cDNA，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ建立反應(yīng)體系，放入LightCy-

cler機器內(nèi)，按照實驗說明進行實時定量PCR。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸5 s，循環(huán)45次。融解分析產(chǎn)物特異性，電泳鑒定產(chǎn)物大小。以β-actin作為內(nèi)參照，用LightCycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對表達水平。本實驗中，除了檢測Osx mRNA的表達外，同時還檢測了核心結(jié)合因子α1（core-binding fac-tor α1，Cbfα1），成骨標(biāo)志基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋素（osteopontin，OPN）、骨

鈣素（osteocalcin，OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和a1（Ⅰ）型膠原蛋白（collagen protein a1，ColⅠ）mRNA的表達，以反應(yīng)細胞的成骨分化情況。其中所用基因引物序列具體見表1。

1.6 Western blot檢測Osx蛋白的表達

收集細胞約5×106個，冰上加入適量（200 μL）細胞裂解液（50 mmol·L-1 Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、1%Triton X-100、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸、10%丙三醇、0.5 mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、10 μg·mL-1亮肽酶素和1 μg·mL-1抑酞酶），裂解細胞，低溫離心，獲取全蛋白上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

取等量蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），后將蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉，加入山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（1∶250）4 ℃過夜，漂洗后加入用TBS稀釋

的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊二抗（1∶2 500），搖動反應(yīng)1～2 h進行雜交，顯色。實驗以actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用JD801圖像分析系統(tǒng)測定目的條帶的相對積分光密度，分析Osx蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜細胞的體外培養(yǎng)和鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見，牙周膜組織塊在5～10 d內(nèi)開始有細胞游出，以組織塊為中心呈放射狀排列生長，20 d爬滿培養(yǎng)瓶。人牙周膜細胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核呈圓形或卵圓形。傳代后細胞生長旺盛，性狀穩(wěn)定，具有成纖維細胞特性。免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果為抗波形絲蛋白陽性、抗角蛋白陰性（圖1）。

2.2 表達載體pcDNA3.1 flag-Osx的酶切鑒定結(jié)果

對提取的表達載體pcDNA3.1 flag-Osx進行酶切鑒定，凝膠電泳觀察結(jié)果見圖2。由圖2可見，得到的目的片段與預(yù)期片段大小一致：pcDNA3.1 flag-Osx經(jīng)Hind Ⅲ雙酶切得Flag-Osx片段；經(jīng)BamH Ⅰ和

Xba Ⅰ雙酶切得Osx片段（約1 200 bp）。

2.3 轉(zhuǎn)染后Osx基因和蛋白表達的檢測

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 flag-Osx后，分別于24、48、72 h抽提總RNA，采用實時RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染24、48、72 h，Osx mRNA表達均比未轉(zhuǎn)染時顯著上調(diào)（P<0.01），24 h時表達最高，隨后逐漸降低（圖3）。

轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA表達水平相對未轉(zhuǎn)染細胞明顯升高28.1倍，同時Osx蛋白亦呈現(xiàn)一個強烈表達（P<0.01）。相反，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的Osx mRNA和蛋白水平相對未轉(zhuǎn)染組無明顯變化（P>0.05）。加力6 h后，3組Osx表達水平均明顯升高，但是相對轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染Osx組Osx mRNA和蛋白表達增強更顯著，增加量約為其他兩組的2倍（圖4、5）。

2.4 轉(zhuǎn)染加力后Cbfα1和成骨標(biāo)志基因的表達變化

轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，Cbfα1及5個成骨標(biāo)志基因（ALP、OPN、OC、BSP 和Col Ⅰ）的mRNA表達變化無明顯差異（P>0.05）。與未轉(zhuǎn)染細胞相比，細胞轉(zhuǎn)染Osx后，Cbfα1 mRNA表達無明顯變化（P>

0.05），但5個成骨標(biāo)志基因的mRNA表達均明顯升高（ALP、Col Ⅰ為P<0.05，OPN、OC、BSP為P<0.01）。ALP、OPN、OC、BSP和Col ⅠmRNA表達水平分別是未轉(zhuǎn)染細胞的2.6、3.1、17.6、5.5和2.6倍。加力

6 h后，3組Cbfα1 mRNA的表達無明顯變化，而ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA的表達水平均升高（P<

0.05）。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，細胞受力后5個成骨標(biāo)志基因變化無明顯差異（P>0.05）；而轉(zhuǎn)染Osx組與未轉(zhuǎn)染組相比，受力后ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ mRNA表達量升高更顯著（P<0.05）（圖6）。

3 討論

Osx是成骨細胞分化和骨形成不可缺少的調(diào)節(jié)因子[10]，其調(diào)控許多重要的成骨早晚期表型和功能蛋

白的表達[5]。Osx過表達可以抑制C3H10T1/2、C2C12 細胞向原來方向分化，同時激活OC和Col Ⅰ的表達，促使細胞發(fā)生成骨分化。而在Osx基因剔除小鼠胚胎中，各種成骨分化標(biāo)志物的表達水平嚴(yán)重降低或缺如，成骨細胞的分化、成熟被完全阻斷[7]。本實驗在

目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及機械加載前后分別檢測了5個成骨標(biāo)志基因mRNA的表達變化。在成骨分化過程中，ALP是一組膜結(jié)合糖蛋白，其活性在成骨分化早期即開始升高，ALP的表達是成骨細胞分化的主要特征之一。OPN是基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)基因[11]，OPN mRNA在

成骨細胞分化的早期即開始表達；在牙齒發(fā)育中，OPN的表達早于BSP，可以作為成骨樣細胞分化的早期標(biāo)志。Col Ⅰ是基質(zhì)礦化支架，通過整合素受體增加成骨細胞黏附能力和發(fā)揮促分化作用[12]。BSP是羥

磷灰石結(jié)合形成的起始位點[13]，可以刺激細胞的增

殖，并促進前成骨細胞分化為骨細胞。BSP的表達早于OC，在成熟晚期即開始表達。OC是細胞外基質(zhì)蛋白，它是成骨細胞成熟的標(biāo)志[14]，OC mRNA表達在礦化期開始，并逐漸達到高峰。

本實驗轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，ALP、OC、OPN、Col Ⅰ和BSP mRNA表達未出現(xiàn)變化，排除了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后對實驗結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)染目的基因Osx后，Osx過表達未改變Cbfα1基因的表達，與以往研究結(jié)果相一致，這可能是因為Osx位于Cbfα1下游發(fā)揮作用[5]；但Osx過表達顯著增強了ALP、OPN、BSP、OC和Col ⅠmRNA的表達。以往研究已證明Osx單獨作用就足以促使許多重要的成骨細胞分化早晚期標(biāo)志基因的表達，發(fā)生礦化反應(yīng)[5]。本實驗結(jié)果說明Osx過表達通過增強ALP、OPN、OC、BSP和Col Ⅰ這些成骨標(biāo)志基因的表達，能夠促進人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化，進而合成骨基質(zhì)，實現(xiàn)礦化成骨。正如Osx過表達能有效誘導(dǎo)鼠胚胎干細胞[15]、骨髓基質(zhì)細胞[16]等分化為成骨細胞系。OC的顯著上調(diào)部

分說明Osx單獨作用即可誘導(dǎo)人牙周膜細胞發(fā)生終末成骨分化。由此可以推測，機械力誘導(dǎo)的人牙周膜細胞內(nèi)Osx高表達同樣也將刺激這些成骨分化早晚期表型和功能基因的表達，推動細胞發(fā)生成骨分化。因此，從某種程度上來說，機械刺激誘導(dǎo)人牙周膜細胞的成骨分化需要通過上調(diào)Osx的表達來實現(xiàn)。

轉(zhuǎn)染Osx組與未轉(zhuǎn)染組相比較，加力作用6 h后，Osx mRNA和蛋白表達進一步增強，ALP、OPN、Col Ⅰ、BSP和OC mRNA表達增強更顯著，實驗結(jié)果證明在機械力誘導(dǎo)人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化過程中，Osx起著促進作用。機械刺激引起Osx表達增強，進而增強成骨標(biāo)志基因的表達，從而促進人牙周膜細胞向成骨樣細胞分化，參與牙周組織改建的骨形成和骨吸收?？梢?，Osx作為一個關(guān)鍵的中間環(huán)節(jié)，在機械力誘導(dǎo)人牙周膜細胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要的信號級聯(lián)放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控作用。

體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞表達成骨細胞的部分表型特征[17]，機械力單獨作用即可誘導(dǎo)人牙周膜細

胞分化成成骨樣細胞[18]。近來研究表明：核內(nèi)轉(zhuǎn)錄

因子參與了細胞內(nèi)調(diào)控途徑，將細胞外物理刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細胞內(nèi)生化反應(yīng)[2-5]。本研究結(jié)果表明Osx可能是一條新的信號傳遞途徑，參與了機械力誘導(dǎo)的人牙周膜細胞成骨分化過程，這對正畸牙齒移動過程中的骨改建具有重要作用。當(dāng)然，Osx在此過程中是否是必需的以及是如何具體發(fā)揮作用的，還需要進一步驗證。牙周膜細胞是一個異質(zhì)性的細胞群，不僅包含具有分化潛能的成纖維細胞群體，同時包含具有多向分化潛能的未分化的成體干細胞，即牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。近年來，隨著人PDLSCs的分離成功和研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PDLSCs不僅具有較強的克隆形成能力，而且表達ALP、BSP、OCN等一系列成骨細胞標(biāo)志物[19]，同時有研究初步證明張應(yīng)力能夠促進PDLSCs向成骨細胞分化，并推測PDLSCs可能是在機械力作用下成骨細胞分化的主要來源細胞，從而介導(dǎo)骨形成和骨吸收[20]。本研究中機械力加載、Osx過表達誘導(dǎo)的人牙周膜細胞系列成骨基因表達，發(fā)生明顯成骨反應(yīng)，可能與牙周膜細胞中PDLSCs的存在和發(fā)揮作用密不可分的。當(dāng)然，具體的檢測和分析還需要借助進一步的實驗研究。

總之，本研究表明：Osx過表達可促進人牙周膜細胞在機械力作用下向成骨樣細胞分化。Osx可能通過介導(dǎo)和調(diào)控多種成骨基因的表達，從而在正畸牙周組織的骨改建過程中發(fā)揮重要作用。

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（本文編輯 杜冰）