毛克舉，李衛(wèi)華，付志遠(yuǎn)，丁 冬，湯繼華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

明確農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀的遺傳機(jī)制對(duì)選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的新品種具有重要的理論意義.然而，由于農(nóng)作物的產(chǎn)量和重要農(nóng)藝性狀多數(shù)表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀，因此，構(gòu)建不同的分離群體通過(guò)QTL定位的方法對(duì)其遺傳機(jī)制進(jìn)行分析成為數(shù)量性狀研究的基礎(chǔ).玉米等作物常用的分離群體主要有 F2，BC1，RIL，DH，IF2等初級(jí)作圖群體.在利用這些群體對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳研究過(guò)程中，由于數(shù)量性狀自身表現(xiàn)的復(fù)雜性，QTL定位往往難以取得令人滿意的結(jié)果［1］.染色體單片段代換系(single segment substitution line，SSSL)概念的提出及大量群體的構(gòu)建為數(shù)量性狀的研究開辟了一個(gè)新的途徑［2～4］.染色體單片段代換系在受體的遺傳背景上只有一個(gè)染色體片段被相應(yīng)供體的染色體片段所代替，具有片段單一、背景一致、遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，可以在群體水平上把復(fù)雜性狀的多基因系統(tǒng)分解為簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳因子，為數(shù)量性狀基因的鑒定、精細(xì)定位、克隆以及應(yīng)用提供保障［3］.在SSSL群體利用中，ESHED等率先以栽培番茄Lycopersicon esculentum為遺傳背景的50個(gè)野生綠果番茄Lycopersicon pennelliide單片段導(dǎo)入系為試驗(yàn)材料，檢測(cè)出23個(gè)番茄可溶性固含物QTL和18個(gè)番茄果實(shí)體積 QTL［4］.SSSLs群體已經(jīng)在番茄、水稻、小麥、玉米、小白鼠等動(dòng)植物的遺傳中發(fā)揮了重要作用，顯示了其在數(shù)量性狀遺傳研究的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［4～6］.但是與其他作圖群體相比，SSSLs的構(gòu)建需要通過(guò)多代的回交同時(shí)結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，煩瑣費(fèi)時(shí)，限制了染色體單片段代換系的廣泛應(yīng)用.新品種的選育與推廣是保證其產(chǎn)量持續(xù)提高的一條有效措施，而對(duì)玉米產(chǎn)量和重要農(nóng)藝性狀遺傳機(jī)理進(jìn)行剖析可以為玉米新品種的選育提供理論依據(jù)［7］.在中國(guó)玉米育種所利用的骨干自交系中，許178具有綜合抗病強(qiáng)、適應(yīng)性廣、對(duì)低氮和低磷反應(yīng)遲鈍等突出優(yōu)點(diǎn)［8］，而自交系綜3則具有配合力高等突出優(yōu)點(diǎn)，但表現(xiàn)出對(duì)水分、低氮等逆境條件下敏感的特點(diǎn)，本研究擬以綜3為供體親本、許178為受體親本，構(gòu)建一套許178遺傳背景的綜3單片段代換系庫(kù)，為鑒定具有特殊性狀的單片段代換系提供材料基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用試驗(yàn)材料中國(guó)玉米育種中的2個(gè)骨干自交系綜3和許178，這2個(gè)自交系分別是大量推廣玉米雜交種豫玉22號(hào)和農(nóng)大108的親本自交系.

1.2 試驗(yàn)方法

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子標(biāo)記連鎖圖譜，按照等間距的原則，選擇平均分布于10條染色體上700對(duì)SSR引物對(duì)許178和綜3進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選.所有引物由上海生物工程有限公司合成.

田間試驗(yàn)于2008—2011年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(鄭州)和海南試驗(yàn)基地(海南省樂(lè)東縣九所鎮(zhèn))進(jìn)行.2010年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)種植BC3F1群體800行，每行10株，于5葉期按行號(hào)混合取樣，利用2個(gè)親本之間存在多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)樣品混合DNA進(jìn)行分析.同時(shí)在田間選擇與許178表現(xiàn)型存在差異的1 300個(gè)單株進(jìn)行回交，于2010年冬在海南加代自交.2011年將BC4F2材料在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)種植成株系，每個(gè)株系種5株，用上一代篩選出的差異標(biāo)記跟蹤檢測(cè)代換片段，每個(gè)株系檢測(cè)1～2株，從中選出含有純合供體片段的單片段代換系.在BC4F2沒(méi)有獲得純合單片段的材料，選取含有雜合單片段材料的自交后代，在BC4F3利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，選擇純合的單片段代換系材料.單片段代換系的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示.

圖1 單片段代換系群體的構(gòu)建過(guò)程Fig.1 The construction procedure of the single segment substitution line

1.3 供體染色體片段長(zhǎng)度的計(jì)算方法

參照YOUNG等［9］的方法計(jì)算代換片段長(zhǎng)度.不考慮2個(gè)相鄰標(biāo)記區(qū)間發(fā)生的雙交換事件，當(dāng)染色體上相鄰標(biāo)記的基因型相同時(shí)，則認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記之間的區(qū)段由相同的標(biāo)記基因型組成.當(dāng)染色體上相鄰標(biāo)記的基因型不同時(shí)，就認(rèn)為這2個(gè)標(biāo)記基因型分別組成這個(gè)區(qū)間的一半.按照微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖圖IBM Neighbour 2008上標(biāo)記間的距離計(jì)算供體片段的長(zhǎng)度 (www.maizegdb.org).

2 結(jié)果與分析

2.1 供體親本與受體親本之間的標(biāo)記多態(tài)性

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子標(biāo)記連鎖圖譜，按照等間距的原則，選用玉米基因組中的700對(duì)SSR引物對(duì)2個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有200對(duì)SSR引物在親本間存在多態(tài)性，多態(tài)率為28.57%(圖2).選用其中172對(duì)帶型明顯、易記錄的SSR標(biāo)記用于回交后代的供體片段檢測(cè)，每條染色體上的SSR標(biāo)記為12～25，標(biāo)記之間的平均圖距為51.58 cM.

圖2 親本多態(tài)性的篩選Fig.2 Screening of parental polymorphism

2.2 單片段代換系群體中的代換片段

經(jīng)過(guò)多代回交、自交結(jié)合SSR分子標(biāo)記檢測(cè)與選擇，剔除不同單片段代換系之間的重復(fù)，在BC4F2和BC4F3分離群體中共篩選選到100份純合的單片段代換系材料(表1).

本研究所獲得的100個(gè)單片段代換系的代換片段不均勻的分布在玉米10條染色體上，其中代換片段數(shù)最多的為第1條染色體，含有22個(gè)片段;其次是第2條染色體，含有16個(gè)片段;最少的為第5條和第7條染色體，均僅有4個(gè)片段.覆蓋率最高的是玉米第4條染色體，覆蓋率為80.24%;覆蓋率最少的為第6條染色體，僅有21.07%(圖3).

表1 各染色體上的代換片段及其覆蓋率Table 1 Distribution and coverage condition of donor substitution segments

所有代換片段長(zhǎng)度為2.25～186.03 cM，總長(zhǎng)度為5 314.80 cM，平均長(zhǎng)度為 53.15 cM，覆蓋玉米基因組的47.85%.其中分布在 2.25 ～50.00 cM的代換片段最多，有55個(gè)，占單片段代換系總數(shù)的55.00%;代換片段長(zhǎng)度分布在 50.0 ～100.00 cM有33個(gè)，占33.00%;代換片段長(zhǎng)度大于100.00 cM有12個(gè)，占12.00%.

3 討論

SSSL內(nèi)供體染色體片段的單一性，消除了遺傳背景及QTL之間互作的干擾，便于鑒定出功能細(xì)小的QTL;利用SSSL與受體表型性狀的簡(jiǎn)單比較，可以把目標(biāo)性狀QTL粗定位于代換片段上;利用不同SSSL之間染色體片段的部分重疊性，可以把數(shù)量性狀QTL定位到更小的區(qū)域內(nèi)(重疊區(qū)或非重疊區(qū)內(nèi))［2］.基于染色體單片段代換系在生物重要性狀遺傳研究中所具有的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建某個(gè)物種的染色體單片段代換系群體對(duì)于基因定位、克隆以及功能分析，和加快分子標(biāo)記輔助聚合育種的進(jìn)程具有重要作用［3］.在 SSSLs 群體構(gòu)建研究中，何風(fēng)華等［10］用 6個(gè)水稻品種為供體，1個(gè)優(yōu)良秈稻品種為受體，用回交和SSR分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，獲得了86 個(gè)SSSL，覆蓋水稻基因組57.10%.宋建東等［11］以粳稻日本晴為受體和輪回親本，以廣西普通野生稻核心種質(zhì)DP 15為供體，通過(guò)連續(xù)回交和SSR標(biāo)記輔助選擇的方法獲得了79個(gè)SSSL，覆蓋水稻全基因組達(dá)98.89%.玉米染色體單片段代換系構(gòu)建方面，袁亮等［12］從BC3F1代開始進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，通過(guò)BC3F1，BC4F1，BC4F2和 BC4F3分離群體的標(biāo)記鑒定，獲得了74個(gè)以9801為遺傳背景的昌7－2染色體單片段代換系.張書紅［13］以玉米自交系綜3為供體，以87－1為受體親本，利用137個(gè)SSR分子標(biāo)記，獲得84個(gè)單片段代換系群體.

染色體單片段代換系的構(gòu)建效率，與輪回親本的回交代數(shù)、起始檢測(cè)世代、檢測(cè)群體的大小、所利用的標(biāo)記數(shù)目等均具有一定的關(guān)系.多輪回交的主要目的是重建受體背景［14］，以保持代換染色體不發(fā)生變化，回交代數(shù)增加將致使導(dǎo)入片段數(shù)量減少.統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng)回交世代高于BC3以后，導(dǎo)入片段數(shù)一般少于4個(gè);同時(shí)導(dǎo)入片段長(zhǎng)度也將逐漸變短，導(dǎo)入片段平均長(zhǎng)度平均在20 cM 以下［15］.本研究所獲得玉米單片段代換系群體的平均長(zhǎng)度為53.15 cM，要大于理論上的平均導(dǎo)入片段長(zhǎng)度，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的一個(gè)主要原因可能與本研究所利用的標(biāo)記密度不夠有關(guān).因此，在以后的研究中應(yīng)該在不同單片段代換系之間篩選新的差異標(biāo)記，構(gòu)建次級(jí)單片段代換系群體，以減少單片段代換系群體的供體染色體長(zhǎng)度.

圖3 100個(gè)單片段代換系的染色體位置Fig.3 Chromosomal position of substitution segments of the 100 SSSLs population

此外，在染色體單片段代換系的構(gòu)建過(guò)程中，初始檢測(cè)群體的大小直接關(guān)系到群體構(gòu)建工作量，為提高構(gòu)建效率，初始檢測(cè)群體一般不需要很大，但分子標(biāo)記數(shù)量要多，且要均勻分布在玉米10條染色體上，以便快速準(zhǔn)確地確定群體內(nèi)代換片段的位置、長(zhǎng)度和數(shù)目，便于后代的跟蹤選擇.由于多片段中間材料是選育單片段代換系的基礎(chǔ)，所以在試驗(yàn)的起始階段就要注重構(gòu)建供體代換片段庫(kù).本研究從BC3代開始利用分子標(biāo)記進(jìn)行供體代換片段檢測(cè)，由于每個(gè)家系內(nèi)導(dǎo)入片段數(shù)理論上一般為4個(gè)，在本研究所利用的800個(gè)BC3基礎(chǔ)家系中供體片段總數(shù)將達(dá)到3 200個(gè)，按每個(gè)片段的平均長(zhǎng)度20 cM計(jì)算，供體片段總長(zhǎng)度將超過(guò)640 000 cM，是玉米基因組的7倍以上，這些基礎(chǔ)材料為構(gòu)建覆蓋玉米全基因組的單片段代換系群體奠定了良好的材料基礎(chǔ).

［1］ 吳為人，唐定中，李維明.數(shù)量性狀的遺傳剖析和分子剖析［J］.作物學(xué)報(bào)，2000，26(4):501 －507.

［2］ 劉冠明，李文濤，曾瑞珍，等.水稻亞種間單片段代換系的建立［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2003，17(3):201－204.

［3］ 曾瑞珍，施軍瓊，黃朝鋒，等.秈稻背景的單片段代換系群體的構(gòu)建［J］.作物學(xué)報(bào)，2006，32(1):88 －95.

［4］ ESHED Y，ZAMIR D.A genomic library of Lycopersicon pennelliin L.esculentum:a tool for fine mapping of genes［J］.Euphytica，1994，79:175 －179.

［5］ 王立秋，趙永鋒，薛亞?wèn)|，等.玉米銜接式單片段導(dǎo)入系群體的構(gòu)建和評(píng)價(jià)［J］.作物學(xué)報(bào)，2007，33(4):663－668.

［6］ 楊武云，胡曉蓉，毛 沛.采用橋梁?jiǎn)误w培育小麥品種問(wèn)染色體代換系的新方法［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1997，12(4):23－27.

［7］ 李九云，于翠紅，高增玉.玉米種質(zhì)資源研究與發(fā)展趨勢(shì)探討［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13(4):58－60.

［8］ 湯繼華，謝惠玲，黃紹敏，等.缺氮條件下玉米自交系葉綠素含量與光合效率的變化［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20(5):10 －12.

［9］ YOUNG N D，TANKSLEY S D.Restiction fragment length polymorphism maps and the concept of graphical genotypes［J］.Theor Appl Genet，1989，77:95 － 101.

［10］何風(fēng)華，席章營(yíng)，曾瑞珍，等.利用高代回交和分子標(biāo)記輔助選擇建立水稻單片段代換系［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2005，32(8):825 －831.

［11］宋建東，黃悅悅，陽(yáng)海寧，等.粳稻為背景的普通野生稻單片段代換系群體的初步構(gòu)建［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41(4):297 －302.

［12］袁 亮，丁 冬，李衛(wèi)華，等.玉米優(yōu)良自交系單片段代換系的構(gòu)建［J］.玉米科學(xué)，2011，20(2):52－55.

［13］張書紅.玉米單片段代換系群體的構(gòu)建和玉米矮花葉病抗病基因的定位［D］.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［14］ LAW C N，WORLAND A J.Inter-varietal chromosome substitution lines in wheat revisited［J］.Euphytica，1996，89:1 －10.

［15］李文濤，曾瑞珍，張澤民，等.F1花粉不育性近等基因系導(dǎo)入片段的分析［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2003，l7(2):95－99.