汪曉東，田亞平

（江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

氨肽酶是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個游離出來的酶，能水解多肽和完整的蛋白質(zhì)分子。氨肽酶不僅存在于高等動物的胰臟、腸液中，而且廣泛分布于多種真菌、細菌和原生動物體內(nèi)，一些真菌和細菌的種類還能向胞外分泌這種酶。氨肽酶的種類很多，根據(jù)最適反應(yīng)底物的不同可分為亮氨酸氨肽酶[1]、甲硫氨酰氨肽酶[2]、脯氨酰胺氨肽酶[3]等。同一種氨肽酶對不同的N端氨基酸殘基的水解能力也不同[4]。其廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[5]、醫(yī)學[6-7]及生物技術(shù)[8]等領(lǐng)域。亮氨酸氨肽酶作為肽酶M1或M17家族的成員之一，是一種水解蛋白質(zhì)分子或者多肽鏈N端亮氨酸殘基的外肽酶，其種類及功能得到了廣泛的研究[9-10]。亮氨酸氨肽酶具有較大的商業(yè)潛力[11]，如在生物活性肽的制備[12-13]、改善食品風味[14]、脫除蛋白水解液的苦味[15]及蛋白質(zhì)的深度水解[16-18]等。此外，其在醫(yī)學上也有廣闊的應(yīng)用前景，如對金黃色葡萄球菌致病性的影響[19]、防止Fasciola hepatica對羊類的感染[20]及對日本血吸蟲感染中的抗體應(yīng)答機制的影響[21]。因此，氨肽酶的工業(yè)化生產(chǎn)對其廣泛應(yīng)用具有重要意義。本文通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、溶氧等發(fā)酵條件及兩階段變溫培養(yǎng)、表面活性劑和滲透壓對氨肽酶分泌的影響的發(fā)酵控制策略來提高枯草芽孢桿菌ZH-Zj016產(chǎn)氨肽酶能力，為其規(guī)模化生產(chǎn)創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌ZH-Zj016 保藏編號：CGMCC No.6559，是通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒PMABSAP轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌Zj016中，獲得的一株遺傳穩(wěn)定高產(chǎn)的亮氨酸氨肽酶菌株；L-亮氨酸-4-硝基苯胺（AR） 美國Alfa公司；其他試劑 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司（上海）；種子培養(yǎng)基10.0g/L蛋白胨，5.0g/L氯化鈉，5.0g/L牛肉膏，pH7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基 可溶性淀粉0.6%，豆粕1.8%，酵母膏2.4%，甘油0.2%，K2HPO4·3H2O 0.6%，CoCl20.6mmol/L，卡那霉素50.0μg/mL，pH8.0；以上培養(yǎng)基均為121℃滅菌20min。

722型分光光度計 上海第三分析儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠；Delta320型酸度計

梅特勒托力多公司；AL204型電子天平 Mettler；立式壓力蒸汽滅菌器 上?；ň€醫(yī)用核子儀器有限公司；TG-328A型電光分析天平 梅特勒公司；Himac CR22G型高速冷凍離心機 日本日立（HITACHI）公司；攪拌式發(fā)酵罐 B.Braun Biotech international；真空冷凍干燥機 Verities。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 搖瓶培養(yǎng)：接種量7‰（V/V），裝液量50mL/250mL，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速220r/min，37℃培養(yǎng)30h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：全自動式15L發(fā)酵罐（B.Braun Biotech international），裝液量8.0L，發(fā)酵溫度（15h前39℃，15h后37℃），接種量7‰（V/V），攪拌轉(zhuǎn)速為250～500r/min，罐壓控制在0.06～0.08MPa，通氣量1.2vvm，溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速相偶聯(lián)，最低溶氧設(shè)定為40%。

1.2.2 發(fā)酵條件的單因素實驗 在裝液量為50mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，發(fā)酵30h條件下，分別對發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、溶氧等條件進行逐一優(yōu)化。

1.2.3 不同表面活性劑及滲透壓對細胞通透性及產(chǎn)氨肽酶酶活的影響 細胞通透性：發(fā)酵液8000×g離心10min后，收集菌體，用去離子水充分清洗，分別溶于各種不同濃度的表面活性劑溶液中，37℃培養(yǎng)10h，檢測體系中氨肽酶酶活的變化。對照加入等體積的去離子水，細胞通透性的調(diào)節(jié)以每克濕菌體中氨肽酶的釋放程度表征。

產(chǎn)氨肽酶酶活：將粗酶液與不同濃度的表面活性劑或NaCl溶液混合，37℃培養(yǎng)10h，考察體系中氨肽酶酶活的變化。對照加入等體積的去離子水。

1.2.4 不同表面活性劑及滲透壓對B.subtilis ZHZj016產(chǎn)氨肽酶分泌過程中的影響 B.subtilis ZHZj016接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃ 220r/min振蕩培養(yǎng)15h后分別添加不同濃度的Tween 80、SDS和NaCl溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣并檢測發(fā)酵液中氨肽酶酶活的變化。

1.2.5 氨肽酶酶活測定方法 采用LNA法，測定時，首先加入2mL Tris-HCl緩沖液和1mL底物（L-亮氨酸-4-硝基苯胺L-leu-pNA），然后再加入1mL稀釋一定倍數(shù)的粗酶液，整個體系體積為4mL，在50℃水浴反應(yīng)10min后，405nm比色測定酶活。

酶活力定義：在50℃水浴下，每分鐘分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺產(chǎn)生1.0μmol的硝基苯胺所需酶量，定義為一個酶活單位。

1.2.6 還原糖的測定 采用3，5-二硝基水楊酸法[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵條件的單因素實驗

2.1.1 培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量對B.subtilis ZHZj016產(chǎn)氨肽酶的影響 培養(yǎng)溫度不僅影響微生物的生長，而且對代謝過程中的關(guān)鍵酶酶活性也有重要影響，從而調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的分泌合成。因此在初始pH8.0時，考察了不同培養(yǎng)溫度條件對B.subtilis ZHZj016產(chǎn)氨肽酶的影響。結(jié)果見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下B.subtilis ZH-Zj016發(fā)酵過程曲線（殘?zhí)呛桶彪拿该富睿〧ig.1 The fermentation curve of B.subtilis ZH-Zj016 under different temperature（residual sugar and aminopeptidase activity）

從圖1可以看出，10h后，在較高的培養(yǎng)溫度下（39、41℃），還原糖消耗較快，可能由于在較高的溫度下，一些參與底物消耗分解及與生長相關(guān)的酶的活力更高，促使微生物的生長代謝、底物消耗速率加快。

在初始培養(yǎng)階段，提高培養(yǎng)溫度更利于氨肽酶的分泌，但培養(yǎng)25h以后，當培養(yǎng)溫度高于37℃時，氨肽酶酶活都有一定程度下降?？赡芤驗樘岣吲囵B(yǎng)溫度，蛋白酶的活性提高，促使氨肽酶的降解加快，且溫度越高，酶的溫定性越差；而較低的培養(yǎng)溫度（35℃）不能為細胞生長及氨肽酶合成提供足夠的活化能，從而使菌體生長及產(chǎn)酶延滯期較長。

在其他條件固定下考察單因素初始pH及接種量的影響，發(fā)現(xiàn)B.subtilis ZH-Zj016的最適初始pH為8.0（見圖2）；在1‰～1%范圍內(nèi)時，接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶影響差異很小，但在7‰接種量時，酶活達到最大值，因此確定最適接種量為7‰（見圖3）。

圖2 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initiation pH on AP production

圖3 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum size on AP formation

2.1.2 溶氧對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 氧氣是好氧微生物所必需的生長因素，溶氧的高低對菌體的生長和代謝有著重要的影響。實驗用轉(zhuǎn)速及通氣量調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中溶氧的水平，分別采取20%（低水平溶氧）、40%（中水平溶氧）、70%（高水平溶氧）三種不同的最低溶氧進行發(fā)酵，結(jié)果見圖4。

圖4 最低溶氧對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of the minimum dissolved oxygen on AP formation

氨肽酶發(fā)酵屬于中等程度的好氧發(fā)酵，溶氧過高或過低都不利于氨肽酶的生產(chǎn)——溶氧過低抑制了菌體的生長進而影響代謝產(chǎn)酶；溶氧過高，菌體生長過快，菌體之間的環(huán)境競爭作用變大，因此大量的營養(yǎng)物質(zhì)被用來構(gòu)建菌體的骨架和新陳代謝，可被用來合成產(chǎn)物的變少。由圖4可知，溶氧40%時，酶活高且菌體量適當，因此選擇40%為最低溶氧水平。

2.2 不同表面活性劑及滲透壓對細胞通透性及氨肽酶酶活的影響

適宜的調(diào)節(jié)細胞通透性的方法不僅要求可以克服由于細胞壁、細胞膜存在而形成的滲透壁障，促進胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放，同時對目的產(chǎn)物本身不應(yīng)具有抑制作用。如表1所示，在所選用的四類試劑中，非離子、陰離子、陽離子表面活性劑及NaCl各個濃度對B.subtilis ZH-Zj016氨肽酶酶活均無明顯抑制作用，因此均具有潛在的調(diào)節(jié)B.subtilis ZH-Zj016細胞通透性、促進氨肽酶分泌的能力。但由于陽離子表面活性劑CTAB對細胞的通透性的調(diào)節(jié)作用相對較差，同時陽離子表面活性劑會影響培養(yǎng)環(huán)境中表面張力、抑制細胞的生長代謝，因此舍棄陽離子表面活性劑CTAB，進一步考察非離子表面及陰離子表面活性劑、滲透壓變化在發(fā)酵培養(yǎng)過程中對B.subtilis ZHZj016細胞通透性的調(diào)節(jié)作用，以提高氨肽酶的分泌。

表1 不同表面活性劑及滲透壓對細胞通透性的調(diào)節(jié)及氨肽酶酶活的影響Table 1 Effect of surfactants and osmotic pressure on cell permeability and AP activity

2.3 不同表面活性劑及滲透壓對B.subtilis ZH-Zj016產(chǎn)氨肽酶分泌過程的影響

初步考察中發(fā)現(xiàn)，B.subtilis ZH-Zj016細胞生長速率在發(fā)酵培養(yǎng)前13h較快。因此為了降低表面活性劑及NaCl對細胞生長及代謝的毒害作用，在獲得較高的菌體量且氨肽酶有一定的積累后（16h），分別加入不同濃度的Tween 80、SDS及NaCl溶液，考察各種溶劑對氨肽酶分泌的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同表面活性劑及滲透壓對菌體產(chǎn)氨肽酶分泌的影響Table 2 Effect of surfactants and osmotic pressure on the secretion of AP

從表2可以看出，在所考察的三種試劑中，SDS所對應(yīng)的氨肽酶酶活較低，而添加NaCl后，氨肽酶酶活有一定程度降低。當發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加不同濃度的Tween 80后，氨肽酶酶活均得到改善，其中當添加濃度為1.5g/L時，氨肽酶酶活達到最大值為138U/mL，所以選擇Tween 80作為調(diào)節(jié)細胞通透性物質(zhì)且其添加濃度為1.5g/L。

2.4 兩階段變溫培養(yǎng)策略在B.subtilis ZH-Zj016產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用

從恒溫培養(yǎng)條件下的搖瓶發(fā)酵過程曲線圖1～圖4可以看出，在B.subtilis ZH-Zj016產(chǎn)氨肽酶的發(fā)酵過程中，溫度對細胞生長、底物利用有著重要影響。因此，提出兩階段溫度控制策略，即在發(fā)酵培養(yǎng)的前15h，控制培養(yǎng)溫度保持在39℃，較高的培養(yǎng)溫度不僅增強了細胞的生長代謝，且在一定范圍內(nèi)溫度越高，膜脂的流動性越好，細胞通透性增加，更易于胞內(nèi)外物質(zhì)的交換；培養(yǎng)15h后，降低培養(yǎng)溫度至37℃并保持到發(fā)酵結(jié)束，結(jié)果見圖5。

圖5 B.subtilis ZH-Zj016在37、39℃及兩階段變溫培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.5 Batch fermentation of AP production by B.subtilis ZH-Zj016 cultivated at 37，39℃ and temperature-shift conditions

在B.subtilis ZH-Zj016培養(yǎng)15h后，將培養(yǎng)溫度由39℃調(diào)整至37℃，此時微生物已進入次級代謝階段，細胞生長基本達到穩(wěn)定，因此采用兩階段變溫培養(yǎng)對細胞的生長影響較小。與37℃單一培養(yǎng)27h相比，菌體整個發(fā)酵周期（30h）縮短了3h，從而提高了生產(chǎn)強度，同時該策略易于操作實施、費用低，在實際生產(chǎn)操作中具有良好的應(yīng)用潛力。

2.5 B.subtilis ZH-Zj016在15L發(fā)酵罐中發(fā)酵過程曲線

在B.subtilis ZH-Zj016產(chǎn)氨肽酶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用兩階段變溫培養(yǎng)、添加適量的Tween 80來調(diào)節(jié)細胞通透性，進一步在15L的小型發(fā)酵罐上實驗，為大規(guī)模化的應(yīng)用和生產(chǎn)創(chuàng)造條件，結(jié)果見圖6。

圖6 B.subtilis ZH-Zj016的發(fā)酵曲線Fig.6 The fermentation curve of B.subtilis ZH-Zj016

從圖6的pH曲線可看出，在15h之前，隨著菌的生長，pH不斷下降，說明菌體生長旺盛時消耗了大量的糖以產(chǎn)生酸性物質(zhì)。由于培養(yǎng)基中含有豐富的蛋白質(zhì)類原料、菌體自身的生長呼吸作用及發(fā)酵過程中通風攪拌等因素的影響，此時發(fā)酵罐中產(chǎn)生了大量的泡沫，可添加適量消泡劑以消除泡沫。培養(yǎng)15h后，此時菌體進入穩(wěn)定期，pH逐漸上升，此時泡沫逐漸減少。發(fā)酵27h結(jié)束時，B.subtilis ZH-Zj016產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為138U/mL，是出發(fā)菌株的21倍。

3 結(jié)論

通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒PMA-BSAP轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌Zj016中，獲得一株遺傳穩(wěn)定高產(chǎn)的氨肽酶菌株ZH-Zj016，對其搖瓶發(fā)酵條件與15L發(fā)酵罐發(fā)酵控制進行研究。在酶活水平相當?shù)那闆r下，兩階段變溫培養(yǎng)與恒溫培養(yǎng)相比，發(fā)酵周期縮短了10%，具有降低成本、提高生產(chǎn)強度、減少發(fā)酵過程染菌機會等優(yōu)點；通過在培養(yǎng)16h后添加適量Tween 80來調(diào)節(jié)細胞通透性，促進了胞內(nèi)氨肽酶的釋放、提高了培養(yǎng)環(huán)境中氨肽酶的酶活；通過最佳溶氧水平的研究，在不影響酶活的情況下，采用中等的溶氧水平（40%），有利于降低能耗從而節(jié)約成本。通過這一系列的發(fā)酵條件優(yōu)化及控制策略，發(fā)酵結(jié)束酶活最高達138U/mL，為大罐及大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)。

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