田蘭，陳春麗，馬曉麗，孟磊，熱娜·卡斯木

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011）

乳及乳制品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人體獲取蛋白質(zhì)的重要途徑。近年來，國(guó)內(nèi)乳制品摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，如三聚氰胺、皮革水解蛋白等非法物質(zhì)的添加，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益和健康。國(guó)家制定的常規(guī)檢驗(yàn)方法，不能將乳品中摻入的非乳蛋白區(qū)別檢測(cè)。因此，從乳制品的特征性成分——乳源蛋白出發(fā)，對(duì)其進(jìn)行定性定量表征，并由此對(duì)乳及乳制品在生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量品質(zhì)進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)，控制，對(duì)于乳品行業(yè)的良性發(fā)展具有重要的意義[1]。

鮮牛乳含有3.0%～3.5%蛋白質(zhì)，其中80%的為酪蛋白（CN），15%為乳清蛋白。酪蛋白分別為：α－酪蛋白（α－CN），β－酪蛋白（β－CN），k－酪蛋白（k－CN），乳清蛋白是在牛乳清液中，此類蛋白質(zhì)主要是α－乳白蛋白（α－La）和 β－乳球蛋白（β－Lg）。乳蛋白由于遺傳和非遺傳的多態(tài)性以及應(yīng)用的加工處理方法，使它們的定量測(cè)定變得十分復(fù)雜。毛細(xì)管電泳使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。長(zhǎng)期困擾我們的生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。高效毛細(xì)管電泳技術(shù)因其高效、快速、微量、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于蛋白的分析[2－5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀：Beckman公司（配有紫外檢測(cè)器）；聚乙烯醇涂層毛細(xì)管柱：Beckman公司（65 cm×50 μm I.D.，有效長(zhǎng)度 47 cm）；PB－ Satorius普及型10pH計(jì)：賽托利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MS3 basic渦旋振蕩器：德國(guó)IKA；Milli－Q Advantage A10超純水儀：美國(guó)密理博；TGL－16G離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ－3200DV型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

α－乳白蛋白（α－La），β－乳球蛋白（β－Lg），α－酪蛋白（α－CN），β－酪蛋白（β－CN），k－酪蛋白（k－CN）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC）：進(jìn)口分裝；DL－二硫蘇糖醇（DTT）生物試劑：Merk；三羥甲基胺基甲烷（Tris）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，檸檬酸，檸檬酸鈉，尿素，磷酸、氫氧化鈉均為分析純；

原料乳取自本地某乳品生產(chǎn)廠家，市售鮮奶購(gòu)自本地集市，其它樣品均購(gòu)自本地超市。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1.1 運(yùn)行緩沖液制備

準(zhǔn)確稱取0.295 4 g檸檬酸鈉，0.156 g二硫代蘇糖醇（DTT），2.0111g三羥甲基胺基甲烷（Tris），置于100mL容量瓶中，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，用H3PO4調(diào)節(jié)pH至8.0，置于冰箱中備用。

1.2.1.2 樣品緩沖液制備

準(zhǔn)確稱取4.208 3 g檸檬酸，0.582 8，g檸檬酸鈉，0.05%羥丙基甲基纖維素，置于100 mL容量瓶中，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至3.0，備用。

1.2.1.3 操作條件

分離電壓20 kV；壓力進(jìn)樣0.5 psi，時(shí)間5 s；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；毛細(xì)管兩次進(jìn)樣之間用水沖洗5 min，檸檬酸緩沖液沖洗5 min，在1 min時(shí)自動(dòng)調(diào)零。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 原料乳、液態(tài)奶樣品的配制

將樣品與樣品緩沖溶液按1∶4（體積比）的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.2.2.2 酸奶樣品

稱取0.4 g酸奶，，加樣品緩沖溶液約1.6 mL，至離心管2 mL處，混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.2.2.3 奶粉樣品的準(zhǔn)備

稱取1 g奶粉，溶于10 mL水中，超聲振蕩使其充分溶解平衡。將樣品溶液與樣品緩沖溶液按1∶4（體積比）的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r/min離心，取清夜，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別配制 α－La 、β－Lg、α－CN、β－CN、k－CN 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：15、20、30、40、20 mg/mL，并置于冰箱中保存。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液均同樣經(jīng)樣品緩沖液處理后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性范圍

在1.2.1.3操作條件下，五種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品高效毛細(xì)管電泳圖譜如圖1所示。

以5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的峰面積的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用最小二階乘法進(jìn)行線性回歸，得到各蛋白的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。

2.1.2 精密度

表1 方法的分析特征Table 1 Analytical characteristics of the method

取同一樣品溶液，在1.2.1.3操作條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定進(jìn)樣精密度；取不同濃度的三份樣品（三種濃度樣品中5種蛋白總含量分別為31.41 mg/mL，21.96 mg/mL和328.54 mg/g進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算進(jìn)樣峰面積，得RSD結(jié)果如表2所示。

表2 乳蛋白的精密度Table 2 Precision of milk proteins

2.1.3 回收率

精密量取適量液態(tài)奶樣品，平行取12份，3份空白，其余9分別加入低中高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2.1方法處理，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果如表3所示。

2.1.4 穩(wěn)定性

2.1.4.1 測(cè)試穩(wěn)定性

將樣品按1.2.2.1項(xiàng)下方法處理之后，在0、12、24、36、40、48、60、64、68、72 h 按 1.2.1.3 操作條件測(cè)定測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

結(jié)果顯示，樣品處理完之后需在64h內(nèi)完成測(cè)定。

2.1.4.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將樣品置于4℃冰箱保存，分別于24、36、48、72 h按項(xiàng)下進(jìn)行樣品處理，測(cè)定，并考察于－18℃保存24 h情況，結(jié)果如表5所示。

表3 乳蛋白的加標(biāo)回收率（n=3）Table 3 Recoveries of the method

表4 乳蛋白測(cè)試穩(wěn)定性Table 4 Stability of milk protein during testing

結(jié)果顯示，樣品可在4℃冰箱中保存72 h測(cè)定，不適合在－18℃冰箱中存儲(chǔ)。

2.2 樣品測(cè)定

分別取液態(tài)奶、酸奶和奶粉樣品，按1.2.2.1項(xiàng)下方法處理之后，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，液態(tài)奶樣品、酸奶樣品及奶粉樣品測(cè)定所得圖譜如圖2、圖3、圖4所示，結(jié)果如表6所示。

從表6的結(jié)果可以看出，本高效毛細(xì)管電泳測(cè)定方法測(cè)得5種蛋白總量的結(jié)果與樣品包裝標(biāo)示量結(jié)果相符。

3 結(jié)論

1）本方法適用于液態(tài)奶、液態(tài)乳制品、酸奶及奶粉中乳蛋白的分析研究。

2）在對(duì)各種樣品的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，各樣品除了蛋白含量不同，圖譜也有差異，可以結(jié)合乳制品形態(tài)、奶源、乳牛喂養(yǎng)、產(chǎn)地、加工工藝等各方面對(duì)原料乳及乳制品的進(jìn)行品質(zhì)控制。也可以借鑒中藥指紋圖譜的分析方法，為原料乳及乳制品建立相應(yīng)的乳蛋白圖譜，并進(jìn)行更為深入透徹的解析。

表5 乳蛋白儲(chǔ)存穩(wěn)定性Table 5 Storing stability of milk protein

表6 乳及乳制品中乳蛋白含量測(cè)定Table 6 Samples determination of milk and milk products

3）本高效毛細(xì)管電泳方法與較為常用的分析手段高效液相（HPLC）法相比，HPLC法主要測(cè)定乳品中氨基酸的含量，該方法前處理方法簡(jiǎn)單（不需要衍生），溶劑消耗低，簡(jiǎn)單易行。但高效毛細(xì)管電泳測(cè)定乳蛋白需要使用涂層毛細(xì)管柱，價(jià)格較高，使用壽命有限（約200份樣品，bekman工程師提供信息），5種乳蛋白的價(jià)格也較高。從方法學(xué)數(shù)據(jù)可以看出，高效毛細(xì)管電泳測(cè)定蛋白質(zhì)含量的精密度、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度與高效液相色譜的常規(guī)測(cè)試中RSD＜2%相比，有一定差距，毛細(xì)管電泳技術(shù)的局限及蛋白質(zhì)的特性限制了高效毛細(xì)管電泳在蛋白測(cè)定中的應(yīng)用。

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[2] 李春,劉麗波,劉寧.毛細(xì)管電泳技術(shù)評(píng)價(jià)乳制品質(zhì)量的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(5):288－290

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[5] 劉婷,姜金斗,劉寧.毛細(xì)管電泳檢測(cè)奶粉中添加的大豆分離蛋白[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(1):37－41