（廣東醫(yī)學(xué)院廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室，廣東湛江 524023）

高良姜（Alpinia officinarumHance）為十大廣藥之一，具有溫中散寒，理氣止痛等功效。近年來報道高良姜提取物具有抑菌、抗癌、抗氧化和清除自由基等多種重要藥理活性[1]，其黃酮類藥用資源堪比銀杏葉，所富含的高良姜素被認(rèn)為是蜂膠的主要活性成分[2-4]。但高良姜十分辛辣，在醫(yī)藥、保健食品等方面的應(yīng)用和劑型選擇上受到限制。本文分離提取出高良姜中的辛辣組分，對分離前后各部分的抗菌作用進(jìn)行評價和比較，探討辛辣組分的分離對高良姜抗菌活性的影響，為高良姜活性成分保健食品的組方和調(diào)味品特色開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

LC-10Avp型高效液相色譜儀：日本，島津；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；超聲清洗儀：上海必能信超聲有限公司；砂芯漏斗（250 mL，直徑70 mm）。DL-CJ-2F實驗醫(yī)用超凈工作臺：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司北京分公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；自動臺式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.1.2 原料與試劑

高良姜：人工種植3年，采于廣東徐聞龍?zhí)伶?zhèn)八角村；乙腈、甲醇、四氫呋喃（HPLC級）：美國TEDIA試劑公司；其它試劑均為分析純；二苯基庚烷A對照品（Diaryl-heptanoid A，DHA）：廣東醫(yī)學(xué)院廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實驗室純化；注射用雙黃連凍干粉針劑：哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號0611008；硅膠G高效薄層板、HF254薄層層析硅膠（200目～300目）：青島海洋化工產(chǎn)品。

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌均由廣東醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室提供。采用MH培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌（培養(yǎng)24 h），采用沙保培養(yǎng)基培養(yǎng)白色念珠菌（培養(yǎng)48 h）。

1.2 方法

1.2.1 高良姜提取物的制備

取高良姜根莖的干燥粉末（40目），以乙酸乙酯超聲提取3次（室溫，30 min/次），提取液減壓濃縮，制備成浸膏，得總提取物；浸膏以 72%乙醇∶石油醚（1∶1，體積比）萃取，分取含水乙醇層和石油醚層；含水乙醇層減壓濃縮制得提取物Ⅰ。采用減壓硅膠柱層析（VLC）對提取物Ⅰ作進(jìn)一步分離。

1.2.2 減壓硅膠層析柱的制備[5]

250 mL砂芯漏斗中裝入薄層層析硅膠（200目～300目），在真空泵減壓條件下裝柱，形成直徑10 cm、高5.5 cm的柱床。在減壓條件下以石油醚活化硅膠柱，并以流動相前沿平行度檢測裝柱質(zhì)量。抽干石油醚后即可上樣。

1.2.3 辣味成分的分離

稱取10 g提取物Ⅰ，用丙酮為溶劑分散于薄層層析硅膠中，干法上樣。選用石油醚-乙酸乙酯體系為洗脫劑，洗脫劑中乙酸乙酯的含量（V/V）依序為30%、33.3%、35%、36%、36.3%、36.6%、38%、39%、40%、41%、42%、100%，每個配比的洗脫劑洗脫1倍柱床體積、并抽干，共得12個餾分。分別收集洗脫液并濃縮，以薄層色譜（Thin-layer chromatogram，TLC）檢測分離效果，并對各組分的辣味進(jìn)行感官檢測。合并36.6%～39.0%餾分為辛辣組分，其余部分合并為非辛辣組分。非辛辣組分標(biāo)記為提取物Ⅱ，辛辣組分標(biāo)記為提取物Ⅲ。

1.2.4 紙片瓊脂擴(kuò)散法抑菌試驗[6]

以雙黃連注射液為陽性對照，采用抑菌圈法測定提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的抗菌活性。菌株選用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌白色念珠菌、大腸桿菌4種，提取物藥液設(shè)3濃度水平3平行，同時作丙酮和蒸餾水作空白對照。用無菌棉拭沾取菌液在MH瓊脂平板（白色念珠菌用沙保瓊脂平板）表面作均勻密集劃線，3 min～5 min后用無菌鑷子將含有藥液的濾紙片緊貼于涂菌瓊脂表面上。將平板置于37℃生化培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h和48 h。以上步驟均在無菌條件下操作。測定各樣品的抑菌圈直徑，計算平行樣的平均值。藥液濃度和抑菌圈測定結(jié)果如表1。

1.2.5 試管二倍稀釋法測定MIC

根據(jù)抑菌實驗的結(jié)果，選取敏感菌測定各藥液的最低抑菌濃度。

1）供試液配制：以95%乙醇將提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別配制成100、72、28 mg/mL3個濃度的供試液；雙黃連粉針劑用蒸餾水配制為8 g/mL的供試液。

2）藥物濃度倍比稀釋取110支試管排成10排，每排11支試管，每種藥物2排（2個平行）。另取2支試管用作“肉湯”和“待測菌生長”對照。每排第1支試管中加入5.7 mL的MH肉湯，每排第2支試管為空管，其余各管內(nèi)加入2 mL的MH肉湯。在每排第1支試管分別中加入0.3 mL藥液，混勻后從中吸取2 mL分別加入第2、3支試管中，混勻后從第3支試管中吸取2 mL加入第4支試管，依次對倍稀釋至11管；同時乙醇陰性對照。

表1 高良姜提取物對4種菌株的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of antibacterial circle of extracts from Galangal for 4 bacteria mm

3）待測菌懸液的制備：挑取孵育18 h～24 h的平板上數(shù)個菌落于3 mL～5 mL生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（約108 cfu/mL）。

4）每排第1支試管及肉湯對照除外，其余各管分別加入40μL菌懸液，使最終細(xì)菌接種量為106 cfu/mL。放在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h（白色念珠菌48 h）后觀察，以無肉眼可見菌生長的最低藥物濃度為該藥的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果見表2。

表2 高良姜提取物對3種菌株的MICTable 2 MIC of extracts from Galangal for 3 bacteria

1.2.6 MBC的測定

MIC測定后，將未見菌生長各管培養(yǎng)物混勻后，吸取0.1 mL于MH瓊脂平板（白色念珠菌用沙保瓊脂平板）上，涂布均勻，每個樣品平行2份，置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h（白色念珠菌48 h）后觀察結(jié)果，以菌落平均數(shù)少于5個的最低藥物濃度為該藥的最低殺菌濃度（MBC），結(jié)果見表 3。

表3 高良姜提取物對3種菌株的MBCTable 3 MBC of extracts from Galangal for 3 bacteria

2 結(jié)果與討論

2.1 分離效果評價

2.1.1 TLC檢測

以1.2.3項下得到的12個洗脫液進(jìn)行薄層色譜分離檢測。取樣 5 μL 點(diǎn)板，以氯仿∶甲醇=99∶1（體積比）展開、5%香草醛-濃硫酸顯色，薄層色譜圖如圖1。

圖1 VLC分離組分的薄層色譜圖Fig.1 TLC Chromatogram of fragments eluted from VLC

圖中色譜軌道由左到右1～12道為VLC洗脫流份，石油醚-乙酸乙酯體系中乙酸乙酯的含量依序為30%、33.3%、35%、36%、36.3%、36.6%、38%、39%、40%、41%、42%、100%（體積分?jǐn)?shù)）。第13道為提取物Ⅰ，第14道為DHA（二苯基庚烷A，辣味成分對照品）。

2.1.2 提取物的HPLC檢測

將提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以甲醇制成每毫升相當(dāng)于0.1g生藥的試液，過0.45μm濾膜；同時以甲醇配制100 μg/mL二苯基庚烷A對照品溶液，進(jìn)行HPLC檢測。液相色譜條件：DiamonsilC18色譜柱（250mm×2.0mm，5.0 μm）；流動相A為0.1%醋酸-水、流動相B為乙腈-甲醇-四氫呋喃（15∶40∶45）；色譜程序為：0～20 min，39%B～61%B；20 min～30 min，61%～100%B；30 min～40 min，100%～100%B；0～19 min，280 nm；19 min～40 min，345 nm；流速0.2 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣體積5 μL。色譜圖如圖2。

圖2中的a、b、c、d四張圖對比表明，提取物Ⅰ中的辣味成分得到了較好的分離，提取物Ⅲ（辣味組分）主峰的保留時間與二苯基庚烷A對照品一致，提取物Ⅲ主峰的歸一化面積比近90%。

圖2 高良姜提取物的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of extracts

2.2 抗菌活性評價

利用VLC從高良姜提取物中分離出的不同部位對4種菌株的抑菌圈、MIC和MBC實驗結(jié)果表明，脫除辣味成分的高良姜提取物Ⅱ?qū)Ω锾m氏陽性菌（金葡，枯草）和真菌（白色念珠菌）均具有明顯的抑制作用，且其抗菌作用強(qiáng)于雙黃連（其MIC和MBC均小于雙黃連200 mg/mL和400 mg/mL）、且呈劑量依賴性。提取物Ⅱ的抗菌作用強(qiáng)于提取物Ⅰ，提取物Ⅲ（辛辣組分）的抗菌作用最弱。

3 結(jié)論

減壓硅膠柱層析（VLC）制備色譜每次可洗脫所選流動相下Rf值大于0.5的組分。每次洗脫后抽干，可以根據(jù)目標(biāo)成分機(jī)動選擇流動相的配比，也可以逐步改變流動相比例實現(xiàn)梯度洗脫。該方法突出了被分離組分之間分配系數(shù)上的差異，受色譜峰擴(kuò)散影響小，可間歇操作，因而具有簡捷、高效的特點(diǎn)，特別適用于天然產(chǎn)物目標(biāo)成分的分離制備[7]。

高良姜提取物Ⅰ富含黃酮類和二苯基庚烷類等芳香類活性成分，從中分離出辣味部位（提取物Ⅲ）后的高良姜提取物Ⅱ，對金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌及白色念珠菌仍有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，活性與提取物Ⅰ基本相當(dāng)、且活性呈劑量依賴性。本實驗表明，對所試的4個菌株，辣味部位（提取物Ⅲ）非高良姜抗菌活性的主要成分。

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