李靜，李瑞芳，王國賢，李云

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州121001;2.邯鄲市中醫(yī)院腦外科，河北 邯鄲056001)

我國2 型糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，這對(duì)人民的健康造成嚴(yán)重威脅。糖尿病性肝病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，持續(xù)高血糖及糖脂代謝紊亂導(dǎo)致脂肪肝、肝纖維化以及炎癥的產(chǎn)生［1]。研究證實(shí)，在高脂高糖狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)氧化、抗氧化系統(tǒng)失去平衡，而抗氧化治療在改善2 型糖尿病及其并發(fā)癥方面的應(yīng)用越來越受到重視。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑之一，它不同于已知的死亡受體途徑和線粒體途徑。多種因素均可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，諸如高血糖、高血脂、高血壓、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活等因素［2-4]。

本研究通過高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)注射的方法建立2 型糖尿病大鼠模型，該模型具有糖脂代謝紊亂、肝臟脂肪變性等特征，再給予α-硫辛酸進(jìn)行干預(yù)治療，并與維生素E比較，探討α-硫辛酸調(diào)節(jié)糖脂代謝，增加抗氧化能力，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制以及對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

α-硫辛酸(美國Sigma 公司)，維生素E(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)，鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司)，血糖檢測(cè)儀(美國強(qiáng)生公司)，空腹血糖、血脂、肝血清酶學(xué)(AST、ALT)等指標(biāo)采用日立7020 全自動(dòng)生化分析儀，丙二醛(MDA)，SOD，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成科技有限公司)，TUNEL 試劑盒(南京凱基科技有限公司)，兔抗大鼠多克隆C-Jun 氨基端激酶(c Jun NH2-terminal kinase，JNK)抗體(Sant Cruz 公司);兔抗大鼠單克隆p-JNK 抗體(Cell Signaling 公司)，SD 大鼠和飼料由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 糖尿病模型的建立與分組

健康雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量150 ～200 g，隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組10 只給予普通飼料飲食(碳水化合物60% +蛋白質(zhì)20% +脂肪10% +纖維素等其他成分10%)，實(shí)驗(yàn)組40 只給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料79% + 膽固醇1% + 蛋黃酚10% + 豬油10%)喂養(yǎng)。1 個(gè)月后對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹12 h，腹腔注射小劑量STZ 35 mg/kg，72 h 后尾靜脈取血測(cè)定血糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L 為造模成功，將造模成功的30 只大鼠隨機(jī)平均分為糖尿病模型組、α-硫辛酸組、維生素E 組。α-硫辛酸組給予60 mg/kg α-硫辛酸，維生素E 組給予20 mg/kg 維生素E，灌胃12 周;對(duì)照組和糖尿病組不予任何處理。

1.3 標(biāo)本收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，經(jīng)頸總動(dòng)脈收集血標(biāo)本，保存在-20℃待測(cè)空腹血糖、血脂、AST、ALT 等指標(biāo)。迅速取出肝組織，配成10%的勻漿，分離血清，測(cè)量肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px 的活性。并迅速將肝組織分解，一部分-80℃凍存，待測(cè)蛋白質(zhì)印跡，另一部分常規(guī)包埋蠟塊待測(cè)TUNEL。

1.4 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)

切片常規(guī)脫蠟水化，按試劑盒說明進(jìn)行肝組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野。計(jì)算出平均每100 個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)(% )表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)JNK 蛋白含量

取-80 ℃凍存肝標(biāo)本100 mg 加入裂解液中剪碎后移入1.5 mL 環(huán)氧樹脂管中，高速離心，取上清液用于蛋白定量。SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，恒壓電泳，室溫封閉4 h，按0.1 mL/cm2膜面積加入一抗(p-JNK 抗體稀釋度1 ∶900，JNK 抗體稀釋度1 ∶1000)，雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 mL/cm2膜面積加入二抗，室溫下?lián)u床雜交1 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2 ～5 min，條帶出現(xiàn)，終止反應(yīng)。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，進(jìn)行灰度分析，以灰度比值表示各組表達(dá)強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖、血脂及肝臟轉(zhuǎn)氨酶的比較

與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、血脂和轉(zhuǎn)氨酶明顯增高(P均＜0.05)。與糖尿病模型組比較，各給藥組肝臟AST、ALT 和血TG 水平降低(P＜0.05);α-硫辛酸組血糖、TG 明顯下降，但血TC 無明顯變化。見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂及肝功能的比較±s，n=10Tab 1 Comparisons of the fasting glucose，blood lipid and liver function index among each group

表1 各組大鼠血糖、血脂及肝功能的比較±s，n=10Tab 1 Comparisons of the fasting glucose，blood lipid and liver function index among each group

a:P＜0.05，與對(duì)照組比較;b:P＜0.05，與糖尿病組比較;c:P＜0.05，與維生素E 組比較

組別 血糖/mmol·L -1 TG/mmol·L -1 TC/mmol·L -1 AST/U·mL -1 ALT/U·mL -1.25 ±0.15糖尿病模型組 24.35 ±3.64a 2.07 ±0.76a 3.38 ±0.58a 27.10 ±0.78a 35.13 ±0.62a維生素E 組 22.61 ±2.81a 1.82 ±0.62a，b 3.07 ±1.25a，b 26.04 ±0.54a，b 29.54 ±0.36a，b α-硫辛酸組 16.87 ±2.56a，b 1.23 ±0.53a，b，c 3.25 ±1.42a 24.81 ±0.15a，b，c 26.55 ±0.18a，b，c F 值 22.741 9.750 11.743 17.471 14.364 P 值對(duì)照組 5.42 ±0.14 0.52 ±0.14 1.57 ±0.12 20.04 ±0.12 17＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各組大鼠肝組織中丙二醛、SOD、GSH-Px 含量的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠MDA 增高，SOD、GSH-Px 顯著降低(tMAD=3.520，tSOD=3.467，tGSH=4.950，P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組肝組織SOD 及GSH-Px 活性均明顯增高。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px 含量±s，n=10Tab 2 Comparisons of the hepatic MDA，SOD，GSH-Px level among each group

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px 含量±s，n=10Tab 2 Comparisons of the hepatic MDA，SOD，GSH-Px level among each group

a:P＜0.05，與對(duì)照組比較;b:P＜0.05，與糖尿病組比較;c:P＜0.05，與維生素E 組比較

組別 MDA/nmol·mg -1 SOD/U·mg -1 GSH-Px/U·mg -1 6.04 ±2.08 45.22 ±6.78 25.36 ±4.48糖尿病模型組 10.90 ±3.38a 34.75 ±6.73a 17.54 ±2.24a維生素E 組 9.72 ±2.36a，b 40.51 ±5.71a，b 20.90 ±2.45a，b α-硫辛酸組 9.45 ±2.13a，b 42.15 ±6.13a，b，c 22.14 ±3.23a，b，c F 值 9.185 23.023 17.043 P 值對(duì)照組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 TUNEL 染色鑒定凋亡細(xì)胞

正常細(xì)胞為藍(lán)紫色，凋亡細(xì)胞為棕色。正常對(duì)照組大鼠有少量肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，糖尿病組和各給藥組均見凋亡細(xì)胞(圖1)。正常對(duì)照組凋亡指數(shù)為(3.02 ±1.15)%，糖尿病組為(26.34 ±7.33)%，α-硫辛酸組和維生素E 組依次為(11.37 ±3.42)%，(17.69 ±4.25)%。

圖1 TUNEL 檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)(×400)Fig 1 Assessment of the apoptotic cells on liver by TUNEL staining

2.4 各組肝組織JNK 蛋白的表達(dá)

對(duì)照組、糖尿病組、α-硫辛酸組、維生素E 組大鼠肝臟組織p-JNK 蛋白表達(dá)水平分別為(0. 45 ±0.05)、(0.84 ±0. 28)、(0. 60 ±0. 07)和(0. 76 ±0.35)。與對(duì)照組比較，糖尿病組p-JNK 蛋白表達(dá)明顯增加(t=4.194，P＜0.01);α-硫辛酸組較模型組明顯下降(t=2.667，P＜0.01);維生素E 組較模型組也明顯下降(t=2. 183，P＜0. 05)。見圖2。比較各組JNK 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠肝臟p-C-Jun 和C-JNK 蛋白水平Fig 2 Protein expression of p-C-Jun and C-JNK in liver by Western blot

3 討論

近年來，氧化應(yīng)激狀態(tài)在代謝綜合征和糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。糖尿病性肝病已成為糖尿病的主要并發(fā)癥之一［5]。糖尿病的代謝紊亂導(dǎo)致的高血糖、高血脂使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成增加或清除不足，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，從而影響組織細(xì)胞的代謝和功能，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，激活相關(guān)促凋亡基因，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6]。因此，氧化應(yīng)激是糖尿病的一個(gè)危險(xiǎn)因子。仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞的特點(diǎn)及其各種功能障礙，使其容易處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，再加上炎癥作用，更加劇了肝損傷。氧化應(yīng)激不僅是肝功能障礙的一部分，也是所有肝損傷的病理生理基礎(chǔ)［1，7-8]。本實(shí)驗(yàn)中，α-硫辛酸治療12 周，可降低2 型糖尿病大鼠血糖水平和血漿中TC、TG 的水平，一定程度上改善了2 型糖尿病的糖脂代謝紊亂，同時(shí)，可使肝臟組織中MDA 含量顯著降低，SOD、GSH-Px 活性顯著升高，伴隨血清轉(zhuǎn)氨酶活性的降低，說明α-硫辛酸在一定程度上修復(fù)了糖尿病時(shí)氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損傷。

ERS 是近年來發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑之一，它不同于已知的死亡受體途徑和線粒體途徑。適量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可保護(hù)細(xì)胞，但過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過長會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ERS 引起的細(xì)胞凋亡有一套自身的信號(hào)傳遞通路，稱為ER 相關(guān)性死亡(ER-associateddeath，ERAD)途徑。ERAD 途徑包含CHOP/GADD153 表達(dá)、JNK 的活化和capase-12 蛋白水解酶的活化［9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)［8]。高脂高糖飼料聯(lián)合STZ 法誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠出現(xiàn)糖脂代謝紊亂，氧化應(yīng)激等因素引起ERS產(chǎn)生，通過JNK 信號(hào)通路激活凋亡前體蛋白Bax，這種分子可以增加線粒體的通透性，使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活胱門蛋白酶-3 和-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病大鼠p-JNK 的表達(dá)顯著高于正常大鼠，證實(shí)糖尿病時(shí)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。其p-JNK 表達(dá)量明顯增高，細(xì)胞凋亡率增加，糖尿病模型組p-JNK 蛋白表達(dá)水平和凋亡率明顯高于正常組。這說明JNK 信號(hào)通路在2 型糖尿病大鼠肝臟疾病中具有重要作用。

α-硫辛酸被譽(yù)為萬能抗氧化劑，具有清除自由基和活性氧的能力［11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠存在著明顯的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而通過α-硫辛酸可調(diào)節(jié)糖脂代謝，增加其抗氧化能力，改善其ERS，推測(cè)其作用機(jī)制可能與其抑制JNK 通路的活化有關(guān)。

［1]谷川久一，秦麗娟. 氧化應(yīng)激與肝?。跩]. 日本醫(yī)學(xué)介紹，2006，27(12):560-562.

［2]Maya L，Villarreal FJ. Diagnostic approaches fordiabetic cardiomyopathy and myocardial fibrosis［J]. J Mol Cell Cardiol，2010，48(3):524-529.

［3]Harmancey R，Taegtmeyer H. The complexities ofdiabetic cardiomyopathy:lessons from patients and animal models［J]. Curr Diab Rep，2008，8(3):243-248.

［4]楊義生，陳家倫.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和2 型糖尿?。跩].中國糖尿病雜志，2006，14(5):393-395.

［5]吳柳，范竹萍.糖尿病與肝病的研究進(jìn)展［J].國際消化病雜志，2008，28(4):326-329.

［6]陳杰，李甘地. 病理學(xué)［M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:18-155.

［7]Portincasa P，Grattagliano I，Palmieri VO，et al. Current pharmacological treatment of nonalcoholic fatty liver［J].Curr Med Chem，2006，13(24):2889-2900.

［8]劉蕓野，謝青.活性氧與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展［J].肝臟，2006，11(4):281-283.

［9]Eizirik DL，Cardozo AK，Cnop M，et al.The role for endoplasmic reticulum stress indiabetes mellitus［J]. Endocr Rev，2008，29(1):42-61.

［10]Diaz-Delfin J，Morales M，Caelles C，et al. Hypoglycemic action of Thiazolidinesdiones/peroxisome proliferator-activated receptor gamma by inhibition of the c-Jun NH2-terminal kinase pathway［J].Diabetes，2007，56(7):1865-1871.

［11]李安林，施用暉，岳鵬，等.硫辛酸對(duì)高脂日糧大鼠脂類代謝和抗氧化能力的影響［J]. 食品科學(xué)，2006，27(5):242-245.