朱文芳，李堅，唐興萍

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.腎內(nèi)科，2.呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的標(biāo)志和特征，也是其治療失敗的主要原因。癌細(xì)胞主要通過循環(huán)系統(tǒng)和淋巴管播散［1]。其可從原發(fā)部位進(jìn)入血液，在血循環(huán)中存活并播散，之后循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)可定位到其他器官部位，在多種細(xì)胞因子作用下，與靶器官的組織發(fā)生細(xì)胞間的相互作用，進(jìn)而生長形成轉(zhuǎn)移灶。已有研究報道，在惡性腫瘤患者的外周血中可檢測出CTC，其與患者的預(yù)后密切相關(guān)。為了探討作為CTC 分子標(biāo)志物的上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)mRNA 和黏蛋白1(MUC1)mRNA 檢測對非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)診斷與病情評估的臨床價值，我們前瞻性研究了實時熒光定量-PCR(qRTPCR)技術(shù)檢測NSCLC 患者外周血EpCAM mRNA和MUC1 mRNA 表達(dá)與臨床病理學(xué)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選自2011年11月至2012年11月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院住院的NSCLC 患者45例，均為未接受過任何抗腫瘤治療的初發(fā)就診病例，并除外其他腫瘤肺部轉(zhuǎn)移?；颊呔?jīng)病理組織學(xué)(纖維支氣管鏡活檢、手術(shù)切除、經(jīng)皮肺穿刺針吸活檢、淋巴結(jié)穿刺活檢)檢查確診為NSCLC。45例患者中鱗癌27例，腺癌18例;其中，男28例，女17例，年齡42 ～88歲，平均63 歲。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年制定的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期18例，Ⅲ+Ⅳ期27例。

另選擇同期住院21例肺部良性疾病患者作為對照組，分別為肺炎9例，慢性阻塞性肺疾病6例，支氣管哮喘2例，間質(zhì)性肺病2例，硅肺病1例，結(jié)核性胸膜炎1例。為評測實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，同時選取健康志愿者14例血標(biāo)本作為對照(樣本mRNA 校對值)。

1.2 方法

1.2. 1 主要試劑和儀器 Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas 公司，熒光定量試劑盒購自日本Toyobo 公司，熒光定量PCR 儀CFX96 購自美國Bio-Rad 公司。

1.2.2 樣本采集 所有入選患者均空腹抽取外周靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管，用淋巴細(xì)胞分離液分離有核細(xì)胞。按Trizol 試劑盒操作說明溶解細(xì)胞，提取總RNA，于紫外分光光度計定量后，嚴(yán)格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3 引物設(shè)計 參考EpCAM基因和MUC1 基因序列設(shè)計引物，另設(shè)計管家基因β-肌動蛋白作為內(nèi)參照，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。見表1。

表1 引物序列Tab 1 Oligonucleotide sequences of primers

1.2.4 qRT-PCR 每份血標(biāo)本均擴增β-肌動蛋白、EpCAM 以及MUC1。按每個反應(yīng)終體積20 μL，其中反轉(zhuǎn)錄混合物2 μL，DEPC 處理水7 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR 混合液10 μL。梯度實驗提示2種基因的退火溫度接近，故PCR 條件均為95 ℃預(yù)變性30 s，按下述步驟循環(huán)，95 ℃5 s;59 ℃30 s;72 ℃30 s延伸，共40 個循環(huán)。

1.2.5 結(jié)果分析 根據(jù)上述方法檢測EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達(dá)，所得的CT 值采用2-ΔΔCT方法計算出靶基因mRNA 相對表達(dá)量，構(gòu)建ROC 曲線，找出確定EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA敏感性和特異性的折點(上限值)，分別為3.02 和1.52，高于該上限值為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。鑒于測得的EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達(dá)量為非正態(tài)分布，兩組間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。EpCAMmRNA 和MUC1mRNA 表達(dá)水平之間的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析。兩組間的陽性率比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達(dá)

NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達(dá)水平均明顯高于肺部良性疾病患者(P=0.025和P=0.018)。NSCLC 患者和肺部良性疾病患者的EpCAM mRNA 與MUC1 mRNA 的表達(dá)水平之間均無明顯相關(guān)性(NSCLC 患者，r=0.135，P＞0.05;肺部良性疾病者，r=0.118，P＞0.05)。以3.02 和1.52分別作為EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達(dá)水平的上限時，NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的陽性表達(dá)率分別為48.9%和53.3%;肺部良性疾病患者陽性表達(dá)率分別為4.7%和0.0%。兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均=0.001)。見表2。

表2 兩組患者外周血中上皮細(xì)胞黏附分子和黏蛋白1 表達(dá)的比較Tab 2 Comparison of mRNA expressions of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)and mucin1 in peripheral blood between two groups

2.2 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 檢測的敏感性和特異性

分別取3.02 和1.52 為EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達(dá)量的上限，檢測其診斷NSCLC 的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。結(jié)果表明，兩者對NSCLC 外周血微轉(zhuǎn)移均有一定的診斷價值。見表3。

表3 外周血中上皮細(xì)胞黏附分子和黏蛋白1 對NSCLC 的診斷價值 %(n/n)Tab 3 Diagnostic value of mRNA expressions of epithelial cell adhesion molecule(EpCAM)and mucin1 in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

2.3 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達(dá)陽性率與臨床病理特征之間的相關(guān)性

結(jié)果顯示(表4)，NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達(dá)陽性率與其年齡、性別、腫瘤病理類型無明顯相關(guān)性;與臨床TNM 分期顯著相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期患者外周血中EpCAM 和MUC1 mRNA 表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(EpCAM mRNA，P=0.021;MUC1 mRNA，P=0.005)。

表4 NSCLC 患者外周血中上皮細(xì)胞黏附分子和黏蛋白1 表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性Tab 4 Correlations between epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)and mucin1 and clinical characteristics in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

3 討論

NSCLC 患者的高病死率與癌細(xì)胞發(fā)生隱匿性微轉(zhuǎn)移有關(guān)。在病程的早期，癌細(xì)胞就可播散到原發(fā)灶的遠(yuǎn)處部位，而傳統(tǒng)的診斷學(xué)方法并不能檢測到這種轉(zhuǎn)移的隱匿性單個癌細(xì)胞或癌細(xì)胞集落。癌細(xì)胞只有以存活狀態(tài)經(jīng)血液循環(huán)黏附于小血管或毛細(xì)血管，才有可能發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。由于RNA 極易被降解，故在NSCLC 患者外周血中檢測到腫瘤特異性基因的表達(dá)，就提示循環(huán)系統(tǒng)中有存活狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞，也就預(yù)示著腫瘤具有較高的轉(zhuǎn)移傾向。目前尚未發(fā)現(xiàn)某個腫瘤特異性基因能在所有NSCLC 中表達(dá)。為此，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR 及相關(guān)技術(shù)，尋找NSCLC 特異性基因的表達(dá)并探討其臨床意義，發(fā)現(xiàn)某些基因的高表達(dá)與NSCLC 患者的預(yù)后存在密切關(guān)系［2-3]。

EpCAM 又稱為腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1(TACSTD1)，是由TACSTD1 基因編碼的Ⅰ型跨膜蛋白。EpCAM 幾乎表達(dá)于所有上皮組織，在上皮來源的腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，但在肝細(xì)胞、結(jié)締組織、造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞、腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)［4]。它通過參與細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化等從而促成腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。Yanamoto等［5]研究顯示，EpCAM 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖活性高，侵襲性強，下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性及侵襲性。Gastl 等［6]在研究乳腺癌組織中EpCAM 表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，36%乳腺癌腫瘤組織中EpCAM 呈高表達(dá)，且該高表達(dá)與患者腫瘤分期和組織學(xué)類型相關(guān)，而與激素受體狀態(tài)、年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)陽性無明顯相關(guān)性。Karanikiotis 等［7]應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測EpCAM 在結(jié)直腸癌患者的外周血和骨髓中的表達(dá)，結(jié)果顯示，26 份外周血(96%)和19 份骨髓樣本(73%)中有EpCAM 表達(dá)，表明EpCAM 在結(jié)直腸癌患者的外周血中呈高表達(dá)。雖然在眾多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Ep-CAM 呈高表達(dá)，但尚未能確定其表達(dá)程度與患者臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系。

黏蛋白(MUC)是廣泛分布于正常機體各種黏膜表面的高分子量蛋白，其中MUC1 是一種Ⅰ型跨膜蛋白，它可降低腫瘤細(xì)胞間的黏附力，從而增強腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使其易于穿過血管壁，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8]。MUC1 對腫瘤細(xì)胞的黏附作用具有雙向調(diào)節(jié)功能。MUC1 在正常肺、支氣管組織和NSCLC 患者的癌組織中均有表達(dá)，但在正常人體外周血中無表達(dá)或低表達(dá)。因此，如果在NSCLC 患者外周血中檢測到MUC1 mRNA呈較高表達(dá)，則提示有循環(huán)腫瘤細(xì)胞存在。蔡祖勛等［9]研究顯示，NSCLC 組織中MUCI mRNA 的陽性表達(dá)率與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)MUC1 的生物學(xué)功能及其與腫瘤的關(guān)系，鄭順利等［10]指出，檢測外周血中MUCI mRNA 的表達(dá)水平是一項衡量肺癌患者有無癌轉(zhuǎn)移的有價值的指標(biāo)，可為臨床醫(yī)師制訂治療方案和評估患者預(yù)后提供重要的參考依據(jù)。

本研究采用qRT-PCR 技術(shù)檢測外周血中mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示，NSCLC 患者EpCAM mRNA和MUC1 mRNA 表達(dá)水平及其陽性表達(dá)率均明顯高于肺部良性疾病患者。檢測外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 診斷NSCLC，特異性(95.3%和100.0%)和陽性預(yù)測值(95.6%和100.0%)均較敏感性(48.9%和53.3%)高。NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 或MUC1 mRNA 呈高表達(dá)，提示有存活的癌細(xì)胞存在，具有較高的轉(zhuǎn)移傾向。因此，檢測兩者mRNA 表達(dá)對NSCLC 患者外周血微轉(zhuǎn)移的診斷有一定的臨床價值。本研究在對NSCLC 患者臨床病理學(xué)特征與外周血EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 陽性表達(dá)率的相關(guān)性進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，兩者陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、病理類型無關(guān);與腫瘤TNM 分期顯著相關(guān)，隨腫瘤TNM 分期增高，mRNA 陽性表達(dá)率明顯增加，提示NSCLC 患者分期越晚，肺癌細(xì)胞脫落至血循環(huán)的可能性越大。

本研究中，部分患者TNM 分期尚處于早期(Ⅰ-Ⅱ期)，其外周血中EpCAM mRNA 或MUC1 mRNA 呈陽性表達(dá)，提示這部分經(jīng)手術(shù)根治性切除的患者可能已有血源性微轉(zhuǎn)移存在。事實上，臨床上確實有一些經(jīng)手術(shù)根治性切除的Ⅰ-Ⅱ期NSCLC患者在術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，說明通過常規(guī)影像學(xué)檢查確定的部分早期(Ⅰ-Ⅱ期)NSCLC 患者已經(jīng)不是真正意義上的早期。因此，根據(jù)血液中Ep-CAM mRNA 或MUC1 mRNA 等腫瘤特異性基因表達(dá)的檢測結(jié)果再重新分期，進(jìn)而調(diào)整或改變治療策略，對于臨床已行TNM 分期的NSCLC 患者而言，具有重要的臨床意義。例如，對于早期發(fā)現(xiàn)的有微轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向的高危患者，在腫瘤負(fù)荷較低的前提下，增加新輔助化療或及時給予輔助化療，有可能降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險［11]。

腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測的臨床價值需要大樣本量的前瞻性隨機對照和長期隨訪研究來論證。由于時間關(guān)系，本研究未能評價NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達(dá)與其預(yù)后的相關(guān)性(NSCLC 患者仍在隨訪中)。

另外，本研究中1例肺部良性疾病患者EpCAM mRNA 呈陽性表達(dá)(陽性率4. 7%)，其原因可能:①血細(xì)胞中EpCAM 假基因的擴增;②RNA 提取過程中的DNA 污染;③局部炎癥侵襲小血管，使其通透性升高或破裂，上皮細(xì)胞逸入循環(huán)等。

綜上所述，我們的研究結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報道表明，檢測外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達(dá)，對于診斷NSCLC，尤其診斷腫瘤微轉(zhuǎn)移可能具有重要的臨床價值。

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