王國賢，劉珊珊，李飛，李兆剛，李瑞芳

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理教研室，遼寧 錦州 121001)

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是最強有力的致心肌纖維化的細胞因子，正常心臟中TGF-β1含量很低，糖尿病患者在高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥等眾多因素的刺激下，體內(nèi) TGF-β1表達上調(diào)，其通過胞內(nèi)信號分子Smads蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，調(diào)控細胞膠原等效應(yīng)基因表達，誘導(dǎo)心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFb)向肌成纖維細胞分化，刺激膠原、纖維連接蛋白、蛋白多糖等的合成［1－2］。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，α-LA)作為一種強抗氧化劑，能消除氧自由基和超氧基的活性，阻止機體的氧化作用，保護機體細胞。大量研究表明，α-硫辛酸對糖尿病及其并發(fā)癥有治療作用，其抗氧化作用已經(jīng)得到證實［3］。本研究著重探討α-硫辛酸能否影響高糖環(huán)境下心肌成纖維細胞TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)途徑的表達，進而影響CFb增殖和膠原合成，以進一步探討這類藥物抗心肌纖維化的心臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生2～3 d的清潔級SD乳鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。

1.1.2 藥品與試劑 α-硫辛酸純品由上海現(xiàn)代浦東藥廠有限公司提供，溶劑為二甲基亞砜(DMSO)，DMSO在細胞培養(yǎng)液中的終體積濃度為0.1%(V/V)。DMEM培養(yǎng)基、血清購自美國Gibco BRL公司;波形蛋白單克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒購自博士德公司;MTT試劑購自Sigma公司;ELISAⅠ型膠原試劑盒購自北京博奧森公司。兔抗大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7和β-肌動蛋白一抗購于Cell Signaling公司，山羊抗兔IgG二抗由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 CFb的培養(yǎng)和鑒定 無菌條件下開胸，迅速取出心臟，用眼科剪將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，加入0.08%胰蛋白酶于37℃水浴并在磁力攪拌器上(速率100 r/min)消化細胞，將收集的上清液離心3次，1 000 r/min，10 min，將所得全部細胞置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，采用90 min差速貼壁法去除心肌細胞。待CFb生長接近融合時以1∶2傳代。實驗采用2～4代CFb。

在倒置顯微鏡下觀察CFb形態(tài);按免疫組化試劑盒說明書，采用SABC法鑒定，所培養(yǎng)的細胞抗波形蛋白抗體陽性、抗α-肌動蛋白單克隆抗體染色陰性，符合成纖維細胞的染色特征，純度達95%以上。

1.2.2 實驗分組和給藥 細胞培養(yǎng)24 h后換無血清培養(yǎng)液饑餓24 h，按不同處理分組:正常糖組(加入葡萄糖5.5 mmol/L)，高糖組(加入葡萄糖25.5 mmol/L)，α-硫辛酸干預(yù)組:高糖 +不同濃度α-硫辛酸(100、200、300 μmol/L)。根據(jù)預(yù)實驗確定的刺激濃度，劑量 ＞300 μmol/L后細胞成活率＜95%。

1.2.3 噻唑藍四氮唑(MTT)比色法檢測CFb增殖取對數(shù)生長期CFb，0.08%胰蛋白酶消化細胞后，用10%FBS-DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×104/mL，接種于 96孔培養(yǎng)板，每孔 200 μL。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h貼壁后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使CFb處于同步生長休止期。給予α-硫辛酸干預(yù)后，再培養(yǎng)48 h，每孔加入15 μL MTT(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上492 nm處測定各孔的光密度(D)值。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測膠原含量細胞37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使CFb處于同步生長休止期。收集培養(yǎng)液上清，并離心。采用雙抗體兩步夾心ELISA測定CFb中膠原Ⅰ的含量，每組實驗設(shè)定6個復(fù)孔，以空白孔調(diào)零，用450 nm波長測量各孔的D值，按照說明書步驟進行操作。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白含量 37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h貼壁后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使CFb處于同步生長休止期，給予不同濃度的α-硫辛酸刺激48 h后，收集細胞，提取總蛋白并測蛋白濃度。將20 μg蛋白樣加入10%的SDS-PAGE凝膠孔中，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，加入1∶1 000稀釋的兔抗大鼠 β-肌動蛋白、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7進行雜交，4℃過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG雜交，通過ECL化學(xué)發(fā)光法，將蛋白條帶顯現(xiàn)于 X膠片上，顯影條帶經(jīng)1200Pro型圖像掃描儀掃描，CAMIAS008圖像分析系統(tǒng)處理。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用 LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFb 鑒定

倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)出的CFb呈梭形或不規(guī)則的三角形，胞體較大，胞質(zhì)淡而幾乎透明，中央有卵圓核，胞質(zhì)向外伸出突起，細胞排列呈放射狀，無搏動。生長至匯合狀態(tài)時發(fā)生接觸抑制，密集時可形成編織狀外觀。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見細胞中波形蛋白染色呈陽性反應(yīng)，肌動蛋白免疫組化染色呈陰性反應(yīng)(細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒樣物質(zhì)的比例小于10%)。見圖1。取5個高倍視野，計數(shù)100個細胞中波形蛋白染色陽性細胞所占比例達95%以上。

2.2 α-硫辛酸對高糖環(huán)境下CFb增殖的影響

在高糖環(huán)境下，細胞給予不同濃度α-硫辛酸刺激24 h后，采用MTT法檢測CFb增殖程度。結(jié)果表明，與正常糖組比較，高糖組D值顯著提高(P＜0.01)。加入不同濃度α-硫辛酸后，D值明顯低于高糖組，且呈濃度依賴性。見表1。

圖1 免疫組化染色鑒定CFb(SABC×400)Fig 1 Immunohistochemical study appraisal CFb(SABC×400)

2.3 α-硫辛酸對高糖環(huán)境下CFb中Ⅰ型膠原生成的影響

給予不同濃度的α-硫辛酸刺激24 h后，采用ELISA方法檢測各組細胞Ⅰ型膠原生成水平。實驗顯示，與正常糖組相比，高糖組中Ⅰ型膠原的表達量明顯增加(P＜0.01);加入不同濃度α-硫辛酸后，Ⅰ型膠原的生成水平均明顯低于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且呈濃度依賴性，見表1。

表1 α-硫辛酸對高糖環(huán)境下CFb增殖及膠原合成的影響 ，n=6Tab 1 Effect of alpha lipoic acid on CFb proliferation and collagen synthesis in high sugar impact

表1 α-硫辛酸對高糖環(huán)境下CFb增殖及膠原合成的影響 ，n=6Tab 1 Effect of alpha lipoic acid on CFb proliferation and collagen synthesis in high sugar impact

與正常糖組比較，a:P ＜0.01;與高糖組比較，b:P ＜0.05;與100 μmol/L 比較，c:P ＜0.05;與 200 μmol/L 比較，d:P ＜0.05

組別 MTT-D值 膠原Ⅰ/μg·mL －1正常糖組0.000 0.000 0.301 4 ±0.025 1 3.21 ±0.67高糖組 0.489 6 ±0.031 5a 7.45 ±1.12a α-硫辛酸干預(yù)組100 μmol/L 0.459 0 ±0.031 6b 6.53 ±1.20b 200 μmol/L 0.407 1 ±0.024 3b，c 4.67 ±1.14b，c 300 μmol/L 0.337 4 ±0.013 1b，d 4.03 ±0.78b，d F 值 44.652 67.682 P值

2.4 α-硫辛酸對CFb中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組心肌成纖維細胞中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3 蛋白表達增加，Smad7蛋白表達減少，P均＜0.01;用不同濃度 α-硫辛酸作用 24 h后，細胞中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表達顯著降低，Smad7蛋白表達升高。見表2、圖2。

表2 α-硫辛酸對CFb中 TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響，n=6Tab 2 Effect of alpha lipoic acid on protein expression of TGF-β，p-Smad2/3，Smad2/3，Smad7 in the CFb

表2 α-硫辛酸對CFb中 TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響，n=6Tab 2 Effect of alpha lipoic acid on protein expression of TGF-β，p-Smad2/3，Smad2/3，Smad7 in the CFb

與正常糖組比較，a:P ＜0.01;與高糖組比較，b:P ＜0.05;與100 μmol/L 比較，c:P ＜0.05;與 200 μmol/L 比較，d:P ＜0.05

Smad2/3 p-Smad2/3 Smad7正常糖組 0.48 ±0.036 0.46 ±0.023 0.29 ±0.032 0.56 ±0.024組別 TGF-β1高糖組 0.87 ±0.051a 0.76 ±0.034a 0.81 ±0.043a 0.31 ±0.032a α-硫辛酸干預(yù)組100 μmol/L 0.81 ±0.034b 0.68 ±0.022b 0.64 ±0.038b 0.36 ±0.043b 200 μmol/L 0.68 ±0.044b，c 0.66 ±0.035b，c 0.52 ±0.021b，c 0.40 ±0.025b，c 300 μmol/L 0.56 ±0.036b，d 0.61 ± 0.043b，d 0.46 ±0.31b，d 0.47 ±0.052b，d F 值 43.184 56.256 62.142 45.154 P值0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

心肌纖維化又稱心臟膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，其核心環(huán)節(jié)是膠原合成增多而降解減少，造成膠原成分在心肌間質(zhì)過度沉積［4］。心肌間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)主要是由 I型和Ⅲ型膠原纖維組成，其中I型膠原蛋白占總量的80%以上，糖尿病心肌病時，心?、瘛ⅱ笮湍z原表達增多，各型膠原比例失調(diào)、排列紊亂，使心肌纖維增粗，心肌供血障礙，心肌僵硬度增加，心室順應(yīng)性下降，最終致心室收縮及舒張功能不全［5］。CFb是誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化的主要細胞，約占心臟非心肌細胞90% ～95%，Ⅰ、Ⅲ型膠原主要由CFb合成分泌，因此它對維持心臟的結(jié)構(gòu)和功能起著不可忽視的作用［6］。

TGF-β1是最強有力的致心肌纖維化的細胞因子，在糖尿病患者中，高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可上調(diào)TGF-β1表達，進一步誘導(dǎo)CFb增殖，促進膠原合成，抑制膠原降解，加劇心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展［7］。本研究結(jié)果顯示，高糖組心肌成纖維細胞TGF-β1蛋白表達水平顯著高于正常糖組，說明糖尿病心肌纖維化可能與TGF-β1過度表達有關(guān)。經(jīng)不同濃度α-硫辛酸干預(yù)后 TGF-β1表達顯著減少，說明 α-硫辛酸可降低糖尿病心肌病中 TGF-β1的表達，從而緩解糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展。

Smad蛋白是作為TGF-β1家族的下游信號分子，是 TGF-β1唯一的底物。有研究顯示，糖尿病心肌病大鼠心臟Smad3表達明顯增加，而 Smad7表達減少，提示 TGF-β1可能參與了心肌纖維化的形成，并且與 Smad3和 Smad7表達失衡有關(guān)［8］。在多種相關(guān)因素的刺激下，TGF-β1首先與細胞膜上的TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，活化后的TGF-β受體I直接磷酸化Smad2和Smad3，并與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，Smad復(fù)合物隨即轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)與特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄［9］。其中，Smad7為抑制性 Smads蛋白(I-Smads)，被認為是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上最重要的負性調(diào)節(jié)因子之一，可與 Smad2、Smad3 競爭性結(jié)合 TGF-β1，阻止Smad2、Smad3磷酸化而阻斷 TGF-β1信號向下傳導(dǎo)［10－11］。實驗結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖組中p-Smad 2/3蛋白表達增高，而Smad 7蛋白表達減低，提示Smad2/3可能參與了糖尿病心肌病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，而Smad7通過對 TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負反饋調(diào)節(jié)，使TGF-β1表達減少，從而起到對糖尿病心肌病的保護作用。α-硫辛酸作為一種強抗氧化劑，可清除活性氧自由基，再生谷胱甘肽，廣泛用于治療多種和氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，它在改善糖尿病血管并發(fā)癥方面的作用備受關(guān)注［12］。實驗顯示，經(jīng)不同濃度α-硫辛酸干預(yù)后，CFb增殖及Ⅰ型膠原含量顯著降低，Smad7蛋白表達明顯上調(diào)，p-Smad 2/3、Smad 2/3表達下調(diào)，且有濃度依賴趨勢，表明α-硫辛酸可影響 TGF-β1的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過下調(diào) TGF-β1、p-Smad 2/3、mad 2/3 表達、上調(diào) Smad7表達，抑制CFb增殖及膠原生成，減輕心肌纖維化，進而對糖尿病時心肌組織起到保護作用。

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