詹莉芳，張曉磊，翁曉琴，張海方，徐順高，黃新祥

(江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種重要的人類腸道致病菌，能引起全身性感染。S.Typhi從外界進入人體時，需要適應宿主體內(nèi)酸、堿、滲透壓、氧和營養(yǎng)等環(huán)境的變化［1］。多種代謝途徑及環(huán)境中活性氧的累積，可對細菌的生理代謝、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)及核酸等物質(zhì)造成一系列的損傷［2］。oxyR(過氧化氫誘導的調(diào)節(jié)活化因子)基因最初在鼠S.Typhi和大腸埃希菌(E.coli)中被報道，其表達蛋白OxyR可以監(jiān)測活性氧的產(chǎn)生，并且通過上調(diào)40多種基因的表達來調(diào)節(jié)細菌的生理代謝［3］，但在S.Typhi中關于 OxyR 的研究還未見報道。本研究擬構(gòu)建S.Typhi oxyR基因缺陷株以及oxyR基因缺陷回補株，通過對其在不同應激下生長曲線的分析，以及熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測氧化應激相關的亞鐵螯合酶(hemH)基因和甘露糖酸脫水酶(uxuA)基因的表達量，研究OxyR蛋白對細菌生存能力的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 野生型 S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大學醫(yī)學院微生物學教研室饋贈;E.coli DH5α、質(zhì)粒 pET28a(Kanr)、質(zhì)粒 pBAD/gⅢ由本室保存;質(zhì)粒pKD46由北京軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所饋贈。

1.1.2 主要試劑與材料 Ex Taq和r Taq DNA聚合酶、XhoⅠ和 EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、dNTP、DL 2 000 DNA標準參照物、T4DNA連接酶、qRT-PCR試劑盒均為TaKaRa公司(大連)產(chǎn)品;Pfu DNA聚合酶、RNA酶為Fermentas公司產(chǎn)品，L-阿拉伯糖、氨芐西林、卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫搖床(Thermo scientific);PCR擴增儀2720 Thermal Cycler(ABI);凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene);核酸檢測儀Speetrophotometer ND-100(NanoDrop);電轉(zhuǎn)化儀Gene Pulsero II(Bio-Rad);超速冷凍離心機5417R(Eppendorf);金屬浴(Grant-bio);分光光度計Bio Photometer(Eppendorf);實時定量PCR儀CFX96TM(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)本室測定的 S.Typhi野生株GIFU 10007基因組序列信息(未公布)和pET28a(Kanr)序列信息，利用Oligo 6.0軟件設計oxyR缺陷株、oxyR缺陷株驗證、oxyR缺陷回補株及qRTPCR引物。

(1)oxyR缺陷株引物設計(圖1):依據(jù)GIFU 10007基因序列顯示，oxyR編碼基因全長918 bp，分別設計2對引物L1-Kl/R1-Kr，L2/R2產(chǎn)生89 bp上下游同源臂，用于敲除oxyR基因全部的開放閱讀框。

(2)oxyR缺陷株驗證引物V-L/V-R設計(圖1):V-L來自基因序列中上游同源臂外側(cè)一段16 bp的序列，V-R來自卡那霉素抗性基因中一段16 bp的序列。

(3)oxyR缺陷回補株引物設計:在oxyR基因上下游設計引物L3/R3，并在5'端分別加上XhoⅠ及EcoRⅠ酶切位點用以連接pBAD/gⅢ載體。

(4)qRT-PCR引物設計:根據(jù)GIFU 10007基因組中的uxuA、hemH基因序列，各自設計一對擴增片段長度為150 bp左右的特異性引物，通過qRT-PCR來檢測這兩個基因的表達情況。所有引物均由上海生工生物技術(shù)服務有限公司合成，見表1。

1.2.2 Red重組功能的誘導和感受態(tài)細胞的制備將編碼Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46電擊轉(zhuǎn)化至S.Typhi野生株中，篩選陽性克隆，作為下一步轉(zhuǎn)化的宿主菌，命名為007-pKD46。挑取007-pKD46單菌落接種于1 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1∶100的比例轉(zhuǎn)種至20 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)至D(600 nm)為0.6，并在培養(yǎng)終止前1 h加入L-阿拉伯糖(終濃度為1 mmol/L)誘導Red系統(tǒng)重組蛋白的表達。離心，收集菌體，用冰浴無菌水漂洗3次，再用10%的無菌甘油漂洗1次，最后將菌體重懸，取50 μL用于電擊轉(zhuǎn)化。

1.2.3 S.Typhi oxyR 缺陷株的制備 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株根據(jù)文獻［4］制備，主要步驟見圖2。以環(huán)狀質(zhì)粒pET28a(Kanr)為模板，用特異性引物L1-Kl/R1-Kr擴增出帶有oxyR基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段F1。然后以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用L2/R2引物擴增出延長了同源臂的片段F2。取2 μg經(jīng)酚-氯仿純化后的F2電擊轉(zhuǎn)化入007-pKD46中，37℃倒置過夜培養(yǎng)后，檢測轉(zhuǎn)化子的生長狀況，然后用菌落進行PCR(引物VL/V-R)，篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子即為oxyR基因缺陷株，命名為ΔoxyR。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

圖2 Red重組系統(tǒng)基因敲除原理示意圖Fig 2 The schematic diagram of Red recombination system for gene knocking out

1.2.4 S.Typhi oxyR基因缺陷回補株的制備 根據(jù)文獻［5］制備，在S.Typhi野生株oxyR基因上下游設計引物L3/R3，并在5'端分別加上 XhoⅠ及EcoRⅠ酶切位點，以S.Typhi野生株GIFU 10007的基因組DNA為模板，用高保真的Pfu DNA聚合酶擴增出目的片段，酚-氯仿純化后由XhoⅠ及EcoRⅠ進行雙酶切反應，通過T4DNA連接酶將其與經(jīng)同樣酶切的pBAD/gⅢ質(zhì)粒16℃連接2 h。用熱擊法將酶接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，篩選陽性克隆并用酶切和PCR進行初步鑒定，再用DNA測序分析驗證(測序由上海生工生物技術(shù)服務有限公司完成)。陽性克隆質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別電擊導入ΔoxyR變異株中，命名為ΔoxyR+pBAD-oxyR，ΔoxyR+pBAD。

1.2.5 生長曲線 分別挑取 S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補株和空質(zhì)粒株單菌落于1 mL等滲LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;過夜細菌以1∶100分別轉(zhuǎn)種于新配制的、預熱的等滲液(NaCl 150 mmol/L)、高滲液(NaCl 300 mmol/L)、酸(pH=4.2)及氧(4 mmol/L H2O2)的LB培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h用分光光度計檢測D(600 nm)值并記錄，直至24 h。每組實驗重復3次，以D(600 nm)值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標制作生長曲線，分別比較4種菌株在不同環(huán)境下的生長狀況。

1.2.6 總 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與 qRT-PCR 分別提取S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補株和空質(zhì)粒株在對數(shù)期氧應激下的總RNA。細菌培養(yǎng)至對數(shù)期后給予氧應激(4 mmol/L H2O2)30 min后，用Trizol法提取 RNA并消化殘余DNA?？俁NA提取后用隨機引物N8反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:4 μg 總 RNA，4 μL N8，1 μL dNTP 和6.7 μL DEPC 處理水，混合后 65 ℃ 1min，冰上迅速冷卻后加入 4 μL 5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.1 μL RNA 酶抑制劑，0.2 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，總體積 20 μL;反轉(zhuǎn)錄反應條件:25℃10 min，50℃ 50 min，70℃15 min。之后按TaKaRa公司的qRT-PCR試劑盒操作說明進行實驗。qRT-PCR實驗重復3次，每次均設平行對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株的制備

以pET28a(Kanr)環(huán)狀質(zhì)粒DNA為模板，L1-Kl為5'端引物，R1-Kr為3'端引物，進行PCR擴增，得到產(chǎn)物F1。以F1片段為模板，L2/R2為特異性引物進行PCR擴增，獲得產(chǎn)物F2。在含卡那霉素(終濃度為50 mg/L)的普通LB平板上培養(yǎng)后，篩選陽性克隆，以V-L和V-R為引物進行PCR，均得到相同的DNA片段，與預期結(jié)果一致，證實ΔoxyR基因缺陷株制備成功。見圖3。

圖3 S.Typhi oxyR基因缺陷變異株的制備Fig 3 Preparation of the oxyR deleted mutant of S.Typhi

2.2 S.Typhi oxyR基因缺陷回補株的制備

以野生株基因組DNA為模板，用引物L3/R3進行PCR擴增，獲得oxyR基因回補片段。將擴增目的片段經(jīng)雙酶切后與同樣雙酶切后的表達載體pBAD/gⅢ進行連接，熱擊導入E.coli DH5α中，獲得陽性初篩菌，將疑似陽性克隆進行酶切和PCR鑒定。經(jīng)DNA測序分析顯示，插入的回補片段與目的基因完全一致，說明含oxyR基因的載體成功轉(zhuǎn)入缺陷株中，S.Typhi oxyR基因缺陷回補株制備成功。見圖4。

2.3 不同菌株在不同應激條件下的生長能力

S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補株和空質(zhì)粒株在等滲、酸、氧及高滲環(huán)境中的生長狀況，如圖5所示。生長曲線分析結(jié)果顯示，在等滲、酸、高滲環(huán)境中，oxyR缺陷株的生存能力與野生株比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而在氧應激條件下，oxyR缺陷株的生存能力明顯低于野生株(P＜0.05)。在各種條件下，回補株的生存能力恢復達到野生株水平，而回補空質(zhì)粒菌株的生存能力與缺陷株比較，差異無統(tǒng)計學意義，說明pBADg/Ⅲ載體對菌株的生存能力無明顯影響。

圖4 傷寒沙門菌oxyR基因缺陷回補株的制備Fig 4 Rescue of oxyR in the oxyR deleted mutant of S.Typhi

圖5 不同菌株在不同應激條件下的生長曲線Fig 5 Growth curve analysis of different strains in different stressive conditions

2.4 qRT-PCR分析氧化調(diào)節(jié)相關基因的表達

為進一步探討OxyR對S.Typhi氧化調(diào)節(jié)相關基因表達的影響，我們分別提取了S.Typhi野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回補株和空質(zhì)粒株在對數(shù)期給予氧應激后的總RNA，并用qRT-PCR分析4種菌株中uxuA、hemH基因的mRNA水平。如圖6所示，氧應激時，與野生株相比，oxyR缺陷株中uxuA基因mRNA的水平顯著升高(P＜0.01)、hemH基因mRNA的水平顯著降低(P＜0.01);與此同時，缺陷回補株uxuA基因和hemH基因的表達水平與空質(zhì)粒株相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖6 氧應激時不同菌株中氧化調(diào)節(jié)相關基因的表達Fig 6 Expression of oxidative stress-related genes in different strains

3 討論

近年來關于OxyR參與基因表達調(diào)控的報道越來越多，在許多革蘭陽性和陰性菌中均可檢測到OxyR。其在細菌的多種代謝活動中都起著重要的作用，包括氧化應激損傷、細菌毒力、生物膜形成、定植以及菌毛合成等［6-9］。

OxyR是轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸家族中的一種蛋白［10］，在氨基末端有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)域，羧基末端有參與調(diào)解寡聚反應的基序。當細菌處于氧應激環(huán)境中，OxyR被氧化，蛋白分子內(nèi)的2個半胱氨酸殘基(Cys199和Cys208)形成二硫鍵，進而結(jié)合到特定靶基因的調(diào)控區(qū)域發(fā)揮作用［11］。OxyR作為一種抗氧化調(diào)節(jié)蛋白，在E.coli中，既可以作為過氧化物探測器，又可以激活相關基因的表達，包括dps(一種在營養(yǎng)缺乏條件下產(chǎn)生的DNA結(jié)合蛋白)、garA(GSH還原酶)、grxA(谷氧還原蛋白)、katG(過氧化氫酶)、aphCF(NADPH氧化還原酶類)以及fur(Fe3+轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白)等基因［12］。此外，E.coli的OxyR激活還可以促進OxyS的產(chǎn)生，進而調(diào)節(jié)20多種基因的表達［13］。然而，OxyR并非總是作為激活劑調(diào)節(jié)基因的表達［14］。在奈瑟菌屬中，當不存在氧化應激時，OxyR則抑制過氧化氫酶的表達;當存在氧化應激時，如受到過氧化物的刺激，則作為激活劑促進過氧化氫酶的表達。白喉棒狀桿菌的OxyR與E.coli相比，具有52%的同源性，也含有監(jiān)測過氧化物的2個半胱氨酸，但是作為cat(過氧化物酶)基因表達的抑制劑，其作用的發(fā)揮不依賴過氧化物誘導的氧化應激［15］。

在本研究中，我們利用λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了S.Typhi oxyR基因缺陷株，為研究OxyR蛋白在S.Typhi中的作用奠定了基礎。我們通過胞外應激條件研究了S.Typhi OxyR對細菌生存能力的影響，結(jié)果顯示，當細菌處于氧應激時，oxyR缺陷株的存活能力明顯下降。qRT-PCR結(jié)果表明，OxyR蛋白激活hemH基因的表達而抑制uxuA基因的表達。HemH參與血紅素的生物合成，并且是過氧化氫酶(katG和katE)合成的輔助因子［12］;UxuA是細菌磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)途徑的重要組分。以上結(jié)果提示，S.Typhi在氧應激時，OxyR可能作為一種調(diào)控因子，直接或間接地激活或抑制一些基因的表達，來對抗所受到的應激。關于S.Typhi OxyR發(fā)揮作用的具體機制以及是否有更多的基因受到調(diào)節(jié)，還有待進一步研究。

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