徐頂巧，周建軍

(陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中，723000)

烏骨雞(Gallus gellus demesticus Brissen)又名烏雞，屬于鳥綱、雞形目、雉科、雞屬。烏骨雞的藥用價值和食用價值存在于體內黑色素物質，其具有抗誘變、提高機體免疫力、延緩衰老、抑制病毒、消除自由基、抗氧化等功能［1－5］，烏骨雞黑色素已被證實是真黑色素［6］。

黑色素是一種不溶于水和幾乎所有溶劑的生物多聚體［7］，黑色素的提取方法有蛋白酶解法、鹽酸水解法等。蛋白酶解法提取時對黑色素在形態(tài)學和化學結構上損傷的程度小于鹽酸法，且清除自由基的效果略優(yōu)于鹽酸法，但其成本較高且在光穩(wěn)定性方面要低;鹽酸水解法對黑色素的形態(tài)和化學結構有一定損傷，但其光穩(wěn)定性較好，操作簡單易行［8］。

以烏骨雞肉、內臟作為原材料提取黑色素的方法已有文獻報道，但其原材料成本較高，難以應用，僅停留在實驗室階段。本實驗以廢棄的黑羽烏骨雞毛為原料，利用鹽酸水解法從烏骨雞毛中提取黑色素，在單因素實驗基礎上通過響應面實驗分析法對烏骨雞毛中黑色素提取工藝進行了優(yōu)化。

1 材料、儀器與試劑

Waters e2695－2489高效液相色譜儀，配有2489紫外檢測器和Empower色譜工作站，自動進樣，美國Waters公司;AB204－S電子天平，瑞士Mettler Toledo公司;KQ5200DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;D-37520 Osterde離心機，德國 Kendro制造;MH-1000電熱套，北京科偉永興儀器有限公司;302型電熱鼓風干燥箱，山東濰坊醫(yī)藥集團股份有限公司醫(yī)療器械廠;SHB-III循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

濃HCl，北京化工廠，分析純;NaOH，西隴化工股份有限公司，分析純;石油醚，天津市富宇精細化工有限公司，分析純;甲酸、30%H2O2、K2CO3、Na2SO3，天津市天力化學試劑有限公司，分析純;甲醇 天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純;5-羥基吲哚-2-羧酸，Sigma公司。

黑羽烏骨雞雞毛，取自漢中市黑鳳園烏雞養(yǎng)殖基地，平均日齡150 d。烏骨雞毛經洗滌晾曬，于65℃烘干備用。

2 實驗方法

2.1 烏骨雞毛黑色素的檢測方法

2.1.1 色譜條件

參考Ito的方法［9］，并經試驗色譜條件確定為:色譜柱 ODS-3 C18柱 (150 mm ×4.6 mm，4 μm)，檢測波長:270 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25℃，進樣量10 μL，流動相 V(1% 甲酸)∶V(甲醇)=60∶40，保留時間:30 min。

2.1.2 對照品溶液的制備

2，3，5-三羧基吡咯(PTCA)的制備參考 Ito的方法［9］:精密稱取 5-羥基吲哚-2-羧酸 50 mg，溶于 50 mL 1.0 mol/L K2CO3溶液中，加入體積分數30%H2O22 mL，置100℃加熱20 min。流水冷卻，加入質量分數10%Na2SO33.0 mL終止反應，用6.0 mol/L HCl調節(jié)pH值至1左右，冷卻，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液濃縮到一定體積，揮干乙醚真空干燥。精密稱取10 mg沉淀，用質量分數0.1%甲酸定容至25 mL，搖勻，作為對照品儲備液(PTCA 濃度為400 μg/mL)。

精密吸取對照品儲備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于5個10 mL的容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，混勻，即配成濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的5個不同濃度的對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的建立

將5個不同濃度的PTCA對照品溶液依次分別進樣10 μL，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，以濃度(X)為橫坐標，用直線回歸方程的方法建立標準曲線，PTCA的直線方程為:Y=9.96×103X－4.99×104(r=0.999 203)，其濃度在20.00 ～100.00 μg/mL內，線性關系良好。

2.1.4 供試品的氧化處理及測定

分別精密稱取(單因素實驗)提取時間3、6 h所得黑色素粗品和響應面模型驗證性實驗所得黑色素粗品各10 mg，加入1.0 mol/L K2CO38.6 mL和體積分數3%H2O20.8 mL，置100℃水浴20 min，流水冷卻后，加入10%Na2SO30.4 mL終止反應，用6.0 mol/L HCl調節(jié)pH值至1左右，過濾后取上清液，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液濃縮到一定體積，揮干乙醚抽真空干燥后，用流動相復溶，定容至25 mL，用0.45 μm有機膜過濾，與標準曲線相同的色譜條件下進樣，重復進樣3次，取平均值，根據標準曲線計算出PTCA的含量，通過黑色素對照樣品與PTCA含量間的換算系數，得出供試品中黑色素的含量。

2.1.5 烏骨雞毛中黑色素含量與PTCA含量換算系數的確定

稱取鹽酸水解黑色素300 mg置于水解裝置中，加入10 mol/L HCl 120 mL，密封置于120℃烘箱內完全水解12 h。揮干鹽酸后，蒸餾水洗凈，沉淀黑色素低溫干燥，作為烏骨雞毛黑色素樣品。分別精密稱取烏骨雞毛黑色素對照樣品10 mg，參考2.1.2對照品溶液的制備方法進行氧化處理，得到對照樣品溶液，按3.1.1同樣色譜條件進樣，測得對照樣品PTCA含量，建立樣品黑色素與PTCA含量間的換算關系。烏骨雞毛黑色素樣品的對照品氧化后PTCA含量見表1。烏骨雞毛黑色素氧化后PTCA平均得率為16.18%，RSD為0.344% 。因此烏骨雞毛黑色素與PTCA間的關系即:黑色素=6.21×PTCA(mg)。

表1 黑色素對照品氧化后PTCA含量Table 1 PTCA yield of the oxygenated standard substance of melanin

2.2 烏骨雞毛黑色素的提取

采用HCl水解法提取，選擇HCl濃度、料液比和提取時間進行單因素實驗，在此基礎上進行響應面實驗，并以黑色素得率(黑色素得率/%=黑色素質量/原材料質量×100)為指標，確定最佳的提取條件，并對最佳提取條件進行驗證性實驗。

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 鹽酸濃度對黑色素得率的影響

稱取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，分別加入10%、15%、20%、25%、30%HCl溶液 150 mL，用帶有吸收氯化氫的熱回流裝置，在110～112℃條件下，熱回流提取5 h，冷卻至室溫后通過滌綸紗布粗濾。將濾液在3 800 r/min條件下離心10 min，棄上清液。沉淀經過多次水洗直到pH為中性，在65℃條件下烘干，即得黑色素粗品。將粗品以1∶10(g∶mL)加入石油醚，超聲2次，每次0.5 h，抽濾，真空干燥得到黑色素樣品，稱重以考察鹽酸濃度對黑色素得率的影響。

2.2.1.2 料液比對黑色素得率的影響

稱取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，分別按 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 加入 25%HCl提取，其他條件固定不變，以考察料液比對黑色素得率的影響。

2.2.1.3 提取時間對黑色素得率的影響

稱取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，其它條件固定不變，分別提取2、3、4、5、6 h，以考察提取時間對黑色素得率的影響。

2.2.2 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，選取料液比 X1(1∶1～1∶3)、HCl濃度 X2(20% ～30%)、提取時間X3(5～7 h)3個對烏骨雞毛黑色素得率影響顯著的因素，以黑色素得率為響應值，采用3因素3水平的響應面分析法，設計方案見表2。

表2 響應面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

3 結果與分析

3.1 單因素實驗結果與分析

3.1.1 鹽酸濃度對黑色素得率的影響

HCl濃度對黑色素得率的影響結果見圖1所示。

圖1 HCl濃度對黑色素得率的影響Fig.1 Effect of the concentration of hydrochloric acid on melanin yield

由圖1可知，隨著HCl濃度的升高，黑色素得率呈明顯遞增趨勢，當HCl濃度達到30%后，黑色素得率最高，在反應過程中，由于HCl在沸騰狀態(tài)極強的揮發(fā)性，再提高HCl濃度黑色素得率也不明顯遞增，故HCl濃度以25%為宜。

3.1.2 提取時間對黑色素得率的影響

提取時間對黑色素得率的影響結果見圖2所示。

圖2 提取時間對黑色素得率的影響Fig.2 Effect of the extraction time on melanin yield

由圖2可知，3 h內隨著提取時間的延長，黑色素的得率呈明顯遞增趨勢，當提取時間達到3 h后，黑色素得率隨提取時間延長而降低，到5 h后，隨著提取時間延長黑色素得率稍有回升，6 h后隨著提取時間延長黑色素得率趨于穩(wěn)定。上述曲線表明，3 h之前可能是水解過程中未完全除去與黑色素結合的蛋白質及脂類物質，因此黑色素得率增高;3 h后，隨著與黑色素結合的蛋白質水解，黑色素得率逐步降低，6～7 h黑色素得率逐步穩(wěn)定。為了證實上述推測對3、6 h提取的黑色素進行了含量測定，結果見表3。

表3 水解3 h及6 h樣品中PTCA得率及黑色素含量Table 3 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample of hydrolysis in 3 h and 6h

由表3可知，水解3h黑色素樣品PTCA得率為4.31%，黑色素含量僅為26.77%;而水解6h黑色素樣品PTCA得率為12.18%，黑色素含量為75.63%，無論是PTCA得率，還是黑色素的含量都明顯高于水解3h的含量，因此水解時間選為6 h。

3.1.3 料液比對黑色素得率的影響

料液比對黑色素得率的影響結果見圖3所示。

圖3 料液比對黑色素得率的影響Fig.3 Effect of the material liquid ratio on melanin yield

由圖3可知，隨著料液比的增大，黑色素得率呈明顯遞增趨勢，當料液比達到1∶2后，黑色素得率趨于平緩，故料液比以1∶2為宜。

3.2 響應面結果及分析

響應面分析方案及實驗結果見表4。表4中1～12是析因試驗，13～17是中心試驗。17個試驗為析因點和零點，其中分析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計誤差。

表4 響應面分析方案及實驗結果Table 4 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

由表5中回歸模型的方差分析可知，上述回歸方程中因變量與各自變量之間線性關系顯著(r=模型平方和/總離差平方和=0.995 2)，該模型高度顯著(P＜0.000 1)，說明此實驗方法可靠。同時由于回歸方程的失擬誤差不顯著(P=0.642 1)，因此該回歸方程可用于實驗結果的分析和預測。各因素的方差分析表明，X1、X2、X3、X1X2、X2X3、對黑色素得率的影響顯著，由此可知各因素對黑色素得率的影響不是線性關系。由分析結果可知，HCl濃度、提取時間和料液比對黑色素得率的影響都達到了高度顯著的水平，其中料液比對黑色素得率的影響最顯著。

RSM圖形是響應值Y對應各因素X1、X2、X3構成的三維空間圖及三維空間圖在二維平面上的等高線圖，本實驗的RSM圖見4～圖6。各個因素交互作用對響應值的影響可以直觀的反映出來，其中等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反。

表5 回歸模型方差分析Table 5 ANONA(analysis of variance)of terms of regression equation

圖4 料液比和HCl濃度對黑色素得率的影響Fig.4 response surface plot showing the effects of water/material ratio and the concentration of hydrochloric acid on extraction yield of melanin

通過對RSM圖進行比較可知，3個因素對響應值影響的顯著性表現為曲線的陡度排列為X1(料液比)﹥X2(鹽酸濃度)﹥X3(提取時間)，即3個因素對黑色素得率影響顯著性大小為料液比﹥HCl濃度﹥提取時間，該結論與回歸方程方差分析的分析結果相吻合。

回歸模型預測的烏骨雞毛黑色素提取的最佳工藝為:料液比1∶2.21，鹽酸濃度27.37%，提取時間6.11 h，在此條件下黑色素得率為4.75%。

圖5 料液比和提取時間對黑色素得率的影響Fig.5 Response surface plot showing the effects of water/material ratio and extraction time on extraction yield of melanin

圖6 鹽酸濃度和提取時間對黑色素得率的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of the concentration of hydrochloric acid and extraction time on extraction yield of melanin

3.3 模型驗證實驗

稱取烏骨雞毛約100 g，結合實際操作情況，將最佳工藝條件修正為:料液比1∶2，鹽酸濃度27%，回流提取6 h，重復3次實驗取均值對回歸模型進行驗證，模型驗證實驗結果見表6。

表6 模型驗證結果Table 6 The results of confirmatory test

由表6可知，實測黑色素平均得率為4.72%，該結果與模型預測值基本相符。

3.4 驗證性實驗所得黑色素粗品中黑色素含量的測定

驗證性實驗所得黑色素粗品中黑色素含量的測定結果見表7。

表7 樣品中PTCA得率及黑色素含量Table 7 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample

4 討論

本實驗以黑羽烏骨雞毛為試材，利用鹽酸水解法提取黑色素，在單因素實驗基礎上，采用響應面分析方法得到了與烏骨雞毛中黑色素提取工藝實際擬合程度較高的模型以及優(yōu)化的烏骨雞毛中黑色素的提取工藝條件:料液比1∶2(g∶mL)，酸濃度27%，提取時間6h，在此條件下烏骨雞毛中黑色素得率為4.72%。提取的黑色素樣品經氧化處理，HPLC檢測，樣品中 PTCA得率為 12.27%，黑色素含量為76.20%。

朱方［10］以烏骨雞肌肉為材料，用鹽酸回流法提取黑色素，工藝條件為提取溫度95℃，料液比1∶4(g∶mL)，時間2h，其烏骨雞黑色素得率為0.458%，與之方法相比，本實驗提高了熱回流的溫度、HCl的濃度及提取時間，所得樣品中黑色素平均得率提高了約10倍;林霖［11］同樣以烏骨雞肌肉為材料，用酶法提取黑色素，其樣品中黑色素含量為63.19%，與其結果相比，本實驗所得樣品中黑色素平均含量提高了13%。因此從廢棄的烏骨雞毛中提取黑色素，不僅降低了黑色素的生產成本，而且能變廢為寶，為黑色素的進一步開發(fā)利用提供了參考依據。

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