李 鵬

去纖維蛋白核苷酸的分離與活性的初步測定

李 鵬

本實驗以豬肺為原料制備分離去纖維蛋白核苷酸，采用定磷法測定其含量，并通過動物實驗考察了它在體內(nèi)、外的抗凝活性。

去纖維蛋白核苷酸；活性；作用

去纖維蛋白核苷酸是一種多聚脫氧核糖核酸鹽。1981年被評定為Defibrotieie（簡稱DEF）。七十年代，意大利學(xué)者[1]Niada.R等發(fā)現(xiàn)DEF纖溶作用機(jī)理是DEF通過促進(jìn)血管壁產(chǎn)生和釋放組織纖溶酶原激活物（t-Pa）發(fā)揮效應(yīng)。近年，Niada.R又發(fā)現(xiàn)其具有抗血栓作用。經(jīng)過人們大量的研究工作發(fā)現(xiàn)了DEF除此之外還具有抗局部缺血、抗粥樣硬化等作用。

1 材料與方法

1.1 材料豬肺。試劑：0.1M Nacl+檸檬酸鈉0.05M混合液。氯仿：異戊醇（24：1 v/v）（沈陽試劑一廠）。分析純KH2PO4（北京化工廠）。牛血清白蛋白（上海醫(yī)學(xué)化驗所）。定磷試劑、試劑甲、試劑乙（自行配制）。儀器：組織攪拌機(jī)、DS-1組織勻漿機(jī)、20PR-5冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計等。動物：小白鼠18～20g、兔子。

1.2 制備方法[2]豬肺細(xì)胞核沉淀DNP沉淀水相(DNA鈉鹽)。①加適量混合液、搗碎、勻漿、離心、收集細(xì)胞核；②用1.71M Nacl提取DNP；③注入蒸餾水中，有沉淀、離心、收集DNP；④用1.71M Nacl溶解、離心加適量氯仿-異戊醇除蛋白；⑤離心、收集水相；⑥注入無水乙醇，脫水，干燥得白色固體。

1.3 含量測定方法[2-3]

1.3.1 定磷法

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①配制標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：稱取分析純KH2PO40.2195g，加蒸餾水至50ml，稀釋100倍，濃度為10ug/ml。②定磷試劑：3M H2SO4：H2O：2.5%鉬酸銨：10%抗壞血酸=1：2：1：1。③制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照下表1取樣及試劑補加水至1.0ml，各加定P試劑3ml，立即搖勻。

表1 定磷法取樣標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1.2 測定總磷量取消化后樣品，如前法測Aλ660。

1.3.1.3 測定無機(jī)磷量取未消化樣品，如前法測Aλ660。

1.3.1.4 核酸含量計算DNA中含磷量9.2%，根據(jù)磷量知DNA量。

1.3.2 Lowry法

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：精密稱取牛血清白蛋白50mg，用水定容至100ml，終濃度為0.5mg/ml；②制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照下表2加入試劑樣品。加水至1.0ml，各加試劑甲5ml，室溫；加試劑乙0.5ml，37℃水浴15’測Aλ550，作A-c圖。

表2 測量Aλ550值的取樣標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2.2 測定未知樣品方法同前

1.4 抗凝活性測定方法[4-5]

1.4.1 體外活性測定樣品液為將DNA溶于3ml 0.05M NaOH+7ml生理鹽水；對照液為3ml 0.05M NaOH+7ml生理鹽水。取一白瓷板，用滴管各加1滴樣品液和對照液，各做三份，晃動瓷板，使液體均勻涂于凹槽內(nèi)，然后從兔耳打孔，讓血流出，滴于瓷板。各凹槽內(nèi)各加2滴兔血，記時。此后每隔20s用針頭挑一次血。每隔1min，傾斜白瓷板，直至垂直白瓷板而血液不流出記時T2，比較空白液和對照液的結(jié)果，測定各批樣品的凝血時間，并且用第二批樣品配成各種濃度，進(jìn)行實驗，以求得具有抗凝活性的最低濃度。

1.4.2 體內(nèi)測定法[6]取小白鼠12只分兩組，用靜脈注射，空白組注射生理鹽水，對照組注射DNA鈉水溶液各加0.2ml，一批為注射兩只，一個為空白，一個為對照。用藥10min后用放血法，每只小鼠取三份血樣，一份為3滴，然后同體外法測凝血時間，對比空白和樣品。

2 結(jié)果

2.1 各批DNA鈉鹽制品產(chǎn)量及收率見表3。

表3 各批次DNA鈉鹽制品產(chǎn)量及收率值

由于提純方法逐漸成熟，樣品顏色有改觀；以后各次產(chǎn)量收率接近，平均收率為1%左右。

2.2 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見表4。

表4 定磷法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線值

第一次回歸方程r=0.985分析原因為定量不準(zhǔn)確，經(jīng)改正后得到第二次標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.9999符合要求，故選擇此方程作為定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 以牛血清蛋白為基準(zhǔn)物，Lowry法制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見表5。

表5 Lowry法得出的蛋白標(biāo)準(zhǔn)值

兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，第一次得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)及縱截距更接近于原點，為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 各批次制品百分含量測定值與測定結(jié)果見表6、7。

表6 各批次含量測定值

表7 各批次含量測定結(jié)果

第一批收率不高，總體純度近70%，剩余部分含有少量糖類及脂類未分離。

2.5 體外活性測定見表8。

表8 體外活性測定值

從表中可以看出，DNA鈉鹽制品有明顯的延長凝血時間的活性，其在血液中最低抗凝濃度近似為150ng/ml。

2.6 體內(nèi)活性測定見表9。

表9 體內(nèi)活性測定值

結(jié)果表明體內(nèi)也具有抗凝活性。

3 結(jié)論

本實驗采用材料為豬肺與以往采用的牛肺相比較，平均收率相近（1%），但豬肺提取的DNA鈉鹽總體純度（70%）稍低于牛肺（80%）。盡管豬肺提取的去纖維核苷酸純度偏低，在抗凝活性卻較高，可見在制備去纖維核苷酸時，不僅要注意純度，而且注意活性降低因素。本實驗對于去纖維核苷酸的制備、含量測定等方面所做工作為其作為治療心血管藥物的研究積累了原始數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步的制備純化及藥理模型實驗開了頭。由于提取方法的去纖維蛋白核苷酸要求具有生物活性，所以實驗過程要盡量低溫操作，使制備處于0～5℃。在活性測定中，由于白瓷板法測定凝血時間每次實驗條件不可能完全相同（如溫度、血液流出情況等），所以其完全凝固時間、空白值不相同，但考慮相對延長時間，仍能看出效應(yīng)。

[1] 周泉生.去纖維蛋白多核苷酸[J].生命的化學(xué),1988(05).

[2] 張龍翔.高級生物化學(xué)實驗選編[M].北京：高等教育出版社, 1989：1.

[3] 蔡武城,袁厚積.生物物質(zhì)常用化學(xué)分析方法[M].北京：科學(xué)出版社,1982.

[4] 中國人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典二部標(biāo)準(zhǔn)附錄?肝素生物檢定法[S].1995.

[5] 徐濤,王榮廷.臨床檢驗基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1986：150.

[6] 徐淑云.藥理實驗方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：886-887.

R927.2

A

1673-5846（2013）01-0129-03

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