巫春寧 林向陽(yáng) 王長(zhǎng)春 鄭為東 葉南慧 吳 佳

WU Chun-ning LIN Xiang-yang WANG Chang-chun ZHENGWei-dong YE Nan-hui WU Jia

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108)

(College of Biology Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou,Fujian 350108,China)

原花青素（proanthocyanidins，PC）是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，屬于植物多酚類物質(zhì)[1]。原花青素水溶性好，極易被機(jī)體吸收，生物利用度高達(dá)90%以上，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化劑和自由基清除劑，其在體內(nèi)抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍[2,3]。

早期的原花青素原料主要來(lái)源于松樹(shù)皮，后來(lái)發(fā)現(xiàn)從葡萄籽中提取的原花青素純度更高、質(zhì)量更好、功效更強(qiáng)，因而成為國(guó)際市場(chǎng)上生產(chǎn)原花青素的最主要原料。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，以葡萄籽提取物——原花青素為主要原料膳食補(bǔ)充劑已被廣泛利用多年，人們每天補(bǔ)充或者使用葡萄籽提取物（原花青素產(chǎn)品）已經(jīng)形成一種良好的生活習(xí)慣，就如同每天補(bǔ)充維生素一樣。

葡萄籽是葡萄酒廠的下腳料，經(jīng)曬干后分離葡萄皮、葡萄梗后所得產(chǎn)物。葡萄籽含有豐富的各種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等。據(jù)中商情報(bào)網(wǎng)[4]數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年1～12月，中國(guó)葡萄酒的產(chǎn)量達(dá)11.6億L，而葡萄籽作為葡萄酒行業(yè)的主要副產(chǎn)品，每年的產(chǎn)量都非?？捎^，而且最近幾年在逐步遞增，為此，可以充分利用這部分資源創(chuàng)造高附加產(chǎn)值。通過(guò)超聲波輔助提取葡萄籽中的原花青素，再將其濃縮，冷凍干燥成粉狀，作為片劑主成分，輔以甘露糖及羥丙甲纖維素（HPCM）等，經(jīng)混合、造粒、干燥、壓片等工序，制成了低熱量、具有保健功能的口含片。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：安徽毫州公司；

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑有限公司；

阿斯巴甜：常茂生物化學(xué)工程股份有限公司；

羥丙甲纖維素（HPCM）：安徽山河藥用輔料有限公司；

藥用滑石粉：廣西桂林市海達(dá)滑石制品有限公司；

聚乙二醇：湖南華日制藥有限公司；

微晶纖維素：安徽山河藥用輔料有限公司；

β-環(huán)糊精：孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司；

香草醛、鹽酸、乙醇、甲醇等：均為分析純，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

三頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超市儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

單沖壓片機(jī)：TDP-1.5型，中南制藥機(jī)械廠；

冷凍干燥機(jī)：FD5-series型，西盟國(guó)際集團(tuán)；

低速離心機(jī)：SC-3612型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：BL150型，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；

低熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1001型，上海愛(ài)明儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄籽中原花青素含量的測(cè)定 采用香草醛—鹽酸法[5]。

1.3.2 樣品中原花青素提取率的計(jì)算 取一定量葡萄籽粉，用乙醇進(jìn)行超聲波浸提后，于離心機(jī)4 000 r/min離心20 min，取0.5 mL上清液，稀釋1倍，測(cè)定其吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中原花青素的含量，并按式(1)計(jì)算其提取率。

式中：

R——原花青素提取率，%；

V——提取液體積，mL；

m——每毫升提取液（稀釋后）中原花青素的量，mg；

M——葡萄籽質(zhì)量，g。

1.4 原花青素提取工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲波頻率對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時(shí)間20min，超聲波功率240W，考察不同超聲波頻率（40，80，100 kHz）對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.2 物料目數(shù)對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g粉碎葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時(shí)間20 min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察過(guò)不同目數(shù)（20,30,40,50,60）的葡萄籽粉末對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.3 乙醇濃度對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時(shí)間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同乙醇濃度（35%，45%，55%，65%，75%，85%，95%）對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.4 超聲波功率對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40 ℃，提取時(shí)間 20min，超聲波頻率 80 kHz，考察不同超聲波功率（120，150，180，210，240，270，300W）對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.5 提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取時(shí)間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同溫度（25，35，45，55，65，75 ℃）對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.6 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取時(shí)間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同時(shí)間(10，20，30，40，50，60min)對(duì)葡萄籽提取率的影響。

1.4.7 液料比對(duì)原花青素提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g過(guò)30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，溫度40℃，提取時(shí)間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同料液比質(zhì)量比分別為(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)對(duì)考察葡萄籽提取率的影響。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分析超聲波頻率、物料目數(shù)、提取溶劑（乙醇濃度）、超聲波功率、提取溫度、時(shí)間、料液比等因素對(duì)指標(biāo)（原花青素提取率）的影響，選出對(duì)其影響最顯著的因素，再采用中心組合設(shè)計(jì)（CCD）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

1.5 提取液的處理及壓片

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)提取液進(jìn)行濃縮后，再冷凍干燥，得粉末狀提取物，再將其運(yùn)用到含片中。以感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（表1）為指標(biāo)，探究輔料種類、配比對(duì)葡萄籽含片組織狀態(tài)、風(fēng)味、口感、硬度、色澤的影響。

表1 口含片感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Marking standards about sensory evaluation of tablet

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 在單因素及綜合分析基礎(chǔ)上，擇優(yōu)選取乙醇濃度、溫度、時(shí)間進(jìn)行RSM三因素三水平試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表2，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面因素與水平表Table2 Factors and levels of RSM

2.1.2 模型的建立及方差分析 由表4可知，試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得模型的F值為22.90，模型P<0.000 1，表示該模型極其顯著。失擬項(xiàng)的F值為0.78，P值為0.602 0不顯著，表明該方程擬合性好，可用回歸方程來(lái)預(yù)測(cè)實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果。

由表5可知，該模型對(duì)超聲波提取葡萄籽中原花青素進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)對(duì)實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。由模型擬合得到的編碼響應(yīng)面二次回歸模型R=+2.49-0.17A+0.019B+0.081C-0.019AB+0.057AC-0.027BC-0.21A2-0.088B2-0.10C2，其方程R2為0.953 7。通過(guò)求方程極值得到的最優(yōu)提取工藝：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時(shí)間42.74 min，最大預(yù)測(cè)值為2.534%。

2.1.3 試驗(yàn)因素及交互作用對(duì)原花青素提取率的影響

(1)乙醇濃度、溫度及其交互作用對(duì)原花青素提取率的影響：由圖1可知，在提取時(shí)間40min條件下，當(dāng)提取溫度為35℃時(shí)，原花青素提取率隨著乙醇濃度的上升而增大，當(dāng)達(dá)到一定值后，又下降，這主要是因?yàn)樵ㄇ嗨匾兹苡跇O性溶劑，但達(dá)到一定限度時(shí)，反而會(huì)隨著溶劑極性的增強(qiáng)而降低。而當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，溫度對(duì)原花青素提取率的影響呈較為平緩的趨勢(shì)。

表3 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Response surface central composite design arrangementand experimental results

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

變異來(lái)源模型A-乙醇濃度B-溫度C-時(shí)間AB AC BC A2 B2 C2殘差失擬項(xiàng)純誤差總值SS 1.29 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 0.063 0.028 0.035 1.36 df 91 1 11 1 1 1 1 1 1 0 5 5 1 9 MS 0.14 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 6.279E-003 5.519E-003 7.038E-003 F 22.90 62.39 0.79 14.38 0.48 4.10 0.91 98.65 17.70 24.70 0.78 P<0.000 1<0.000 1 0.394 5 0.003 5 0.502 2 0.070 3 0.362 2<0.000 1 0.001 8 0.000 6 0.602 0顯著度********不顯著

表5 模型可信度分析Table5 Analysis ofmodel reliability

(2)乙醇濃度、時(shí)間及交互作用對(duì)原花青素提取率的影響：由圖2可知，在溫度45℃條件下，當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)，原花青素提取率隨著乙醇濃度的上升而增大，當(dāng)達(dá)到一定值后，又下降。當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，原花青素提取率會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，而后呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì)，當(dāng)超聲波時(shí)間較短時(shí)，原花青素不易溶出，原花青素提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)一方面，耗時(shí)，另一方面提取液經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間超聲空化效應(yīng)，增加了超聲波作用強(qiáng)度，破壞了原花青素母核的結(jié)構(gòu)，且導(dǎo)致溫度升高，不利于原花青素的提取[6,7]。

(3)溫度、時(shí)間及交互作用對(duì)原花青素提取率的影響：由圖3可知，在乙醇濃度為75%條件下，當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)，原花青素提取率隨著溫度的上升而增大，當(dāng)達(dá)到一定值后，又下降。當(dāng)溫度為35℃時(shí)，原花青素提取率會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，而后呈平緩，略微下降趨勢(shì)。

圖1 乙醇濃度，溫度及其交互作用對(duì)原花青素提取率的影響Figure 1 Effectof Concentration of ethanol,tempertature and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

圖2 乙醇濃度，時(shí)間及其交互作用對(duì)原花青素提取率的影響Figure 2 Effectof Concentration of ethanol,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

圖3 溫度，時(shí)間及其交互作用對(duì)原花青素提取率的影響Figure 3 Effectof temperature,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

2.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取條件：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時(shí)間42.74 min，在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。原花青素提取率為2.521%，相對(duì)于預(yù)測(cè)值2.534%，其相對(duì)誤差為0.51%，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

2.2 壓片工藝

2.2.1 填充劑、黏合劑對(duì)含片質(zhì)量的影響 由表6可知，甘露醇和乳糖的填充效果最佳，3%的HPCM的黏合效果最好。由于水易被物料迅速吸收，難以分散均勻，造成結(jié)塊等現(xiàn)象，所制成的顆粒也松緊不勻而影響片劑的質(zhì)量[8]；而用80%乙醇和8%淀粉漿，雖然效果會(huì)好些，但制成的顆粒粉末較多，顆粒大小分布不均勻,且操作過(guò)程中要迅速，以免醇揮發(fā)后，軟材變硬或結(jié)塊，影響制粒[9]。故綜合考慮選用3%HPCM乙醇溶液作為黏合劑，進(jìn)行壓片。甘露醇在口腔含化過(guò)程中，有負(fù)熱效應(yīng)，故在口腔中溶解有清涼感，適用于口含片，但若選用單一的甜味劑，甜味較為單調(diào)，不夠醇厚，再者甘露醇流動(dòng)性較差而且價(jià)格較貴，故將甘露醇配合乳糖（4∶1）、矯味劑（阿斯巴甜）進(jìn)行壓片使用。

表6 填充劑、粘合劑對(duì)含片感官質(zhì)量的影響Table6 Effectof filler and adhesive on aesthetic quality of tablet

2.2.2 潤(rùn)滑劑對(duì)含片質(zhì)量的影響 休止角越小，說(shuō)明顆粒具有更好的流動(dòng)性，據(jù)表7可知硬脂酸鎂的潤(rùn)滑效果最好，可以使含片的片重均勻，而且能減少粘沖現(xiàn)象，使含片表面光滑。從感官評(píng)定得分，知硬脂酸鎂的添加較不會(huì)對(duì)含片口感產(chǎn)生影響，而加滑石粉制得的口含片口感較差，有苦味，而加聚乙二醇制成的片子脫膜效果好，但其本身有苦澀味，口感不佳[10-13]。

表7 潤(rùn)滑劑對(duì)含片感官質(zhì)量的影響Table7 Effectof lubricanton aesthetic quality of tablet

2.2.3 干燥溫度及時(shí)間對(duì)含片質(zhì)量的影響 軟材造粒后，要迅速干燥，否則易結(jié)塊，影響后續(xù)的壓片效果。因含片中葡萄籽提取物（主要成分原花青素），在高溫下易氧化，而失去功效，且會(huì)造成軟材中的糖分熔化，使顆粒容易結(jié)塊、堅(jiān)硬；而干燥溫度過(guò)低，又將延長(zhǎng)干燥時(shí)間，降低生產(chǎn)效率。由表8可知，造粒后置于烘箱中50℃干燥90min制得的含片顆粒緊湊，硬度合適，無(wú)裂片，碎片。

2.2.4 葡萄籽提取物的包合及配方研究 因葡萄籽提取物，有苦澀味，穩(wěn)定性不好，故選用β-環(huán)糊精對(duì)葡萄籽提取物進(jìn)行包埋，以此來(lái)掩蓋其苦澀味。經(jīng)前期試驗(yàn)，得出將0.45 g葡萄籽提取物置于45℃、50 g的β-環(huán)糊精飽和溶液中包埋42min，得到的包埋物口感效果好。而后考察包合物與填充劑的配比（總用量92%）情況，檸檬酸與阿斯巴甜配比(總用量2%)對(duì)含片配方的影響。

由表9可知，當(dāng)包合物與填充劑配比為1∶3，檸檬酸與阿斯巴甜配比為1∶1時(shí)，得出的葡萄籽含片外形圓整(直徑0.8 cm)，含片表面光滑，色澤均勻，入口順滑，清涼爽口，酸甜適宜，每片重（0.27±0.03）g。

表8 干燥溫度及時(shí)間對(duì)含片感官質(zhì)量的影響Table8 Effect of drying temperature and time on aesthetic quality of tablet

表9 主輔配料對(duì)含片質(zhì)量的影響Table9 Effectof ingredients on aesthetic quality of tablet

3 結(jié)論

(1)采用超聲波輔助提取葡萄籽中的功能性成分——原花青素，通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析得出提取最佳工藝條件：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時(shí)間42.74 min,在此條件下，原花青素提取率為2.521%，相對(duì)于預(yù)測(cè)值2.534%，其相對(duì)誤差為0.51%，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

(2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進(jìn)行濃縮后，于冷凍干燥機(jī)中干燥制成粉末，將其用于含片的制作，得出當(dāng)包合物與填充劑配比1∶3（92%），檸檬酸與阿斯巴甜配比為1∶1（2%），3%HPCM的乙醇溶液（4.5%），硬脂酸鎂為1%時(shí)，得出的葡萄籽含片（0.27±0.03）g/片表面光滑，色澤均勻，入口順滑，清涼爽口，酸甜適宜，適合廣大消費(fèi)群體的功能性保健含片。

(3)葡萄籽提取物，輔以不同的配料，經(jīng)混合、造粒、干燥、壓片等工序，雖制成了低熱量口含片，但還缺少含片的滅菌及包裝，具體的保健效果及功效還有待考究，后期將對(duì)含片功能性成分的釋放及對(duì)人體的保健效果進(jìn)行深入探究。

1 周坦洋,羅芙蓉,白彬.葡萄籽原花青素生物藥理活性的研究進(jìn)展[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,46(1):94～96

2 Debasis B，Manashi B，Sidney J S.Freeradical and grape seed proanthocyanidinextract:importancein human health and disease prevention［J］.Toxicology,2000,148:187～197.

3 Bagchi D,Garg A,Krohn R L,et al.Oxygen free radical scavenging abilities of Vitamins C,E and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro[J].Research Communication in Molecular Pathology and Pharmacology,1997,95(2):179～189.

4 中商情報(bào)網(wǎng).2011年中國(guó)葡萄酒產(chǎn)量增長(zhǎng)13%[EB/OL].（2012-01-20）[2013-01-18].http://www.askci.com/news/201201/20/152732_96.shtm l.

5 李春陽(yáng),許時(shí)嬰,王璋.香草醛—鹽酸法測(cè)定葡萄籽梗中原花青素含量的研究[J].食品科學(xué)，2004,25(2):157～160.

6 師繪敏.枇杷籽原花青素的超聲波輔助提取[J].食品工業(yè),2012,33(8):22～22.

7 趙兵.循環(huán)超聲提取技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用[C]//中藥提取技術(shù)(國(guó)際)研討會(huì)會(huì)議論文.北京:中國(guó)醫(yī)藥設(shè)備工程協(xié)會(huì),2005:26～29.

8 王銳平,陳雪峰,王寧,等.大棗口含片生產(chǎn)工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2007,28(1):154～156.

9 曹德英,王靜.藥物劑型與制劑設(shè)計(jì)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009.

10 王世寬,郭春曉.馬齒莧保健含片生產(chǎn)工藝的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006,27(9):74～76.

11 彭瀟波.玉竹多糖提取及其口含片的制備工藝研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2011.

12 王屹.蜂花粉含片加工工藝研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2009.

13 楊生輝,羅光宏.無(wú)糖軟兒梨含片生產(chǎn)工藝研究[J].食品科技,2008(1):43～45.

14 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.