郭 珍 陳復(fù)生 方志鋒

GUO Zhen CHEN Fu-sheng FANG Zhi-feng

（河南工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450001）

(Henan University of Technology,Zhengzhou,Henan 450001,China)

花生中富含脂肪和蛋白質(zhì)，既是主要的食用植物油來源，又可提供豐富的植物蛋白質(zhì)。其中花生蛋白含量在22%～26%，花生中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值與動物蛋白質(zhì)差異不大，比牛奶、豬肉、雞蛋的蛋白質(zhì)含量都高，而且膽固醇含量低，其營養(yǎng)價(jià)值在植物性蛋白中僅次于大豆蛋白[1]。由于花生中脂肪含量高達(dá)45%，在生產(chǎn)花生蛋白時(shí)必須先將油脂分離出去，而傳統(tǒng)的制油方法均采用壓榨或預(yù)榨—浸出的方法，過程中由于受到溫度的作用均難保證蛋白質(zhì)的質(zhì)量，因此，尋求一種新型分離花生蛋白技術(shù)具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

反膠束萃取技術(shù)是20世紀(jì)70年代提出的一種分離技術(shù)。反膠束是將表面活性劑溶于非極性溶劑中，通過偶極—偶極或離子對之間的相互作用形成的一種各向同性、光學(xué)上透明并且熱力學(xué)上穩(wěn)定的聚集體。在反膠束溶液中，表面活性劑非極性頭朝外與溶劑接觸，極性頭朝內(nèi)增溶一部分水形成“水池”，蛋白質(zhì)等生物分子通過與“水池”之間相互作用實(shí)現(xiàn)萃取[2]。由于能形成反膠束的單一表面活性劑并不多或性質(zhì)上有一定的局限性，且研究[3，4]發(fā)現(xiàn)，把不同類型表面活性劑混合起來制備可以形成具有良好性質(zhì)的混合反膠束體系，增加增溶水量。因此，本試驗(yàn)試圖選擇AOT/SDS復(fù)合反膠束進(jìn)行花生蛋白萃取，并通過正交優(yōu)化選擇最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

全脂花生粉：河南帝鑫食品有限公司；

丁二酸二異辛酯磺酸鈉(AOT)：上海海曲化工廠；

十二烷基硫酸鈉(SDS)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

卡爾費(fèi)休液：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；

異辛烷、正辛醇：分析純，天津市博迪化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：BS210S型，德國Sartorius公司；

高速冷凍離心機(jī)：GL-20L型，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；

自動水分滴定儀：ZSD-2J型，上海安亭電子儀器廠；

酸度計(jì)：pH 211型，意大利Hanna公司；

移液槍：Nichipet EXII型，日本Nichiryo公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 根據(jù)文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 原料蛋白含量測定 按GB/T 50095——2010第二法執(zhí)行。

1.2.3 反膠束溶液中WO測定 根據(jù)文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 AOT/SDS復(fù)合反膠束配制 按一定的質(zhì)量比稱取AOT，SDS置于100mL錐形瓶，同時(shí)加入有機(jī)溶劑異辛烷，正辛醇，使其溶解，加入一定量一定濃度KCl的KH2PO4—Na2HPO4緩沖溶液，超聲振蕩至溶液透明。

1.2.5 花生蛋白的萃取 將配制的AOT/SDS反膠束溶液置于100mL錐形瓶中，加入一定量花生粉，超聲處理一段時(shí)間，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液，用紫外分光光度計(jì)在280 nm處測定其吸光值(反膠束溶液作為空白液)。

1.2.6 花生蛋白提取條件的優(yōu)化 以測定蛋白質(zhì)前萃率為指標(biāo)，分別考慮超聲時(shí)間、花生濃度、超聲功率、pH、離子濃度、溫度、W0值、AOT(g)∶SDS(g)值以及表面活性劑濃度對萃取率的影響?；緱l件：超聲時(shí)間20 min，花生濃度0.01 g/mL，超聲功率270W，pH值為7，離子濃度為0.01 mol/L，溫度35 ℃，W0值 12，AOT（g）∶SDS（g）為 4∶3，表面活性劑濃度0.07 g/mL。本試驗(yàn)單因素設(shè)計(jì)中各因素變化值：超聲時(shí)間3，6，9，12，20，25，30，35，40 min；花生濃度 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06g/mL； 超 聲 功 率 150，180，210，240，270，300 W；pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0；離子濃度 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L；溫度 25，30，35，40，45，50 ℃；W0值5，7，9，12，15；AOT(g)∶SDS(g)為 2∶3，3∶4，1∶1，4∶3，3∶2，2∶1；表面活性劑濃度 0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.11 g/mL。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化花生蛋白提取工藝。

1.2.7 蛋白質(zhì)前萃率的計(jì)算 按式(1)進(jìn)行。

式中：

R——花生蛋白前萃率，%；

m1——反膠束溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；

m2——原料中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of protein quantitative analysis

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲時(shí)間對前萃率的影響 由圖2可知，萃取率隨時(shí)間的延長而增加，12min后基本達(dá)到最大，這是由于原料中蛋白不斷向“水池”中遷移，使?jié)舛炔顪p小，萃取效率降低最終達(dá)到平衡，與單一表面活性劑形成的反膠束體系相比，萃取速度明顯加快，這可能是由于降低了臨界膠束濃度形成了更多的“水池”。

圖2 超聲時(shí)間對花生蛋白前萃率的影響Figure 2 Impacton peanut protein extraction rate by ultrasonic time

2.2.2 花生濃度對前萃率的影響 由圖3可知，萃取率隨花生濃度的增加而降低，主要原因是花生濃度的增加使空間位阻增加，而反膠束的聚集數(shù)以及增溶水量是固定不變的，花生蛋白之間的相互競爭致使萃取率降低。

圖3 花生濃度對蛋白前萃率的影響Figure 3 Impact on peanut protein extraction rate by peanut concentration

2.2.3 超聲功率對前萃率的影響 由圖4可知，萃取率隨超聲功率的增加先增加后降低。超聲波的空化作用以及機(jī)械效應(yīng)為反膠束萃取提供了一定的推動力，降低分子擴(kuò)散阻力，加快溶劑以及蛋白分子擴(kuò)散速度，增加蛋白分子進(jìn)入“水池”的可能性，從而使萃取率增加。此外，與單一使用SDS表面活性劑形成的反膠束體系相比節(jié)約能耗[7]。

圖4 超聲功率對花生蛋白前萃率的影響Figure 4 Impact on peanut protein extraction rate by ultrasonic power

2.2.4 pH值對前萃率的影響 由圖5可知，萃取率隨pH值升高呈先增大后減小。據(jù)報(bào)道[8]，蛋白質(zhì)與反膠束之間的靜電引力是萃取的主要推動力，而在試驗(yàn)中，pH等于8時(shí)萃取率最高，此時(shí)，蛋白分子帶負(fù)電，與AOT、SDS帶同種電荷，因此，有可能存在離子交互作用以及蛋白質(zhì)疏水作用等影響著萃取過程。

圖5 pH值對花生蛋白前萃率的影響Figure 5 Impact on peanut protein extraction rate by pH

2.2.5 離子濃度對前萃率的影響 由圖6可知，萃取率隨著離子濃度的增加先緩慢增加后快速下降。隨著鹽濃度增加時(shí)，表面活性劑周圍的電層厚度變薄，減小了表面活性劑極性頭之間的排斥作用，使反膠束變小，從而使蛋白質(zhì)在反膠束中的增溶量減小，此外，鹽濃度的增大同時(shí)對反膠束產(chǎn)生脫水效應(yīng)，萃取率降低[9]。

圖6 離子濃度對花生蛋白前萃率的影響Figure 6 Impact on peanut protein extraction rate by ionic concentration

2.2.6 溫度對前萃率的影響 由圖7可知，萃取率隨溫度的增加先升高后降低，在40℃時(shí)達(dá)到最大。溫度升高一方面會增加分子熱運(yùn)動，使傳質(zhì)速率增加從而增加萃取率，另一方面，溫度過高會破壞反膠束結(jié)構(gòu)，同時(shí)使蛋白分子變性[10]。

圖7 溫度對花生蛋白前萃率的影響Figure 7 Impact on peanut protein extraction rate by temperature

2.2.7 W o對前萃率的影響 W o是反膠束的一個(gè)重要參數(shù)。反膠束物理性質(zhì)主要取決于W o，W o決定了反膠束的大小和每個(gè)膠束中所含表面活性劑的個(gè)數(shù)。研究[11]發(fā)現(xiàn)，隨著W o的增加，反膠束直徑增加，且滿足以下關(guān)系式dwp=0.29W o+1.1(2

圖8 W o對花生蛋白前萃率的影響Figure 8 Impacton peanut protein extraction rate by W o

2.2.8 AOT(g)∶SDS(g)對前萃率的影響 由圖9可知，萃取率隨AOT(g)∶SDS(g)的升高呈先增大后減小。在比值為3∶2時(shí)達(dá)到最大，這有可能是因?yàn)榛旌媳砻婊钚詣└淖兞伺R界膠束濃度，AOT與SDS非極性端存在的排斥作用影響著反膠束的大小，形狀以及增溶水的能力，有待進(jìn)一步研究。

圖9 AOT(g)/SDS(g)對花生蛋白前萃率的影響Figure 9 Impact on peanut protein extraction rate by AOT(g)/SDS(g)

2.2.9 表面活性劑濃度對前萃率的影響 由圖10可知，隨著表面活性劑濃度的升高萃取率逐漸降低。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在表面活性劑濃度小于0.06 g/mL時(shí)無法配成反膠束溶液。其原因可能是在濃度為0.06 g/mL時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)萃取率最高，繼續(xù)增加表面活性劑的量阻礙了蛋白質(zhì)的萃取。

圖10 表面活性劑濃度對花生蛋白前萃率的影響Figure 10 Impacton peanut protein extraction rate by Surfactant concentration

2.3 正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

選取影響萃取的7個(gè)主要因素：溫度、KCl濃度、pH、反膠束濃度、AOT/SDS、超聲功率、WO，在花生濃度 0.01 g/mL，超聲時(shí)間15min條件下，以萃取率為指標(biāo)進(jìn)行七因素三水平正交優(yōu)化，確定萃取最佳工藝。因素水平表見表1，正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镚>D>B>C>E>A>F，超聲功率對試驗(yàn)結(jié)果影響最小，可以歸為誤差項(xiàng)。由表3可知，WO對花生蛋白前萃率影響極其顯著，反膠束濃度以及KCL濃度對花生蛋白前萃率影響顯著，溫度、pH值、AOT與SDS比值對花生蛋白前萃率影響不顯著。由表2可知，A1B1C2D3E1F1G3為最優(yōu)方案，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(n=7)，在此條件下，萃取率為93.33%。即最佳萃取條件為溫度35℃，KCl濃度0 mol/L，pH 8，反膠束濃度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)為 4∶3，超聲功率180W，WO值為 15。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonal testand results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99。

差異源 自由度F 顯著性A B C D E G 1.570 21.551 7.624 45.366 7.200 577.658****誤差項(xiàng)(F)離差平方和18.064 247.950 87.720 521.955 82.838 6 646.186 11.505 41 2 2 2 2 2 2 2均方v9.032 123.975 43.860 260.977 41.419 3 323.093 5.752 706

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用AOT、SDS與異辛烷正辛醇形成的復(fù)合反膠束對花生中蛋白質(zhì)進(jìn)行萃取，研究發(fā)現(xiàn)，不僅萃取率得到提高，且萃取時(shí)間大大縮短，形成反膠束的效率也有很大提升，與單一反膠束體系相比表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，通過單因素以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了最佳工藝條件：溫度35℃，KCl濃度0mol/L，pH 8，反膠束濃度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)為 4∶3，超聲功率180W，W o值為15。但AOT、SDS在溶劑中是通過怎樣的連接方式形成反膠束，以及萃取過程中的相互作用力，萃取模型都尚未清楚，有待進(jìn)一步研究。

1 周瑞寶,周兵,姜元榮.花生加工技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：188～195.

2 Luisi P L,Giomini M,Pileni M P,et al.Reverse micelles as hosts for proteins and smallmolecules[J].Biochimica et Biophysica Acta,1988(947):209～246.

3 Mitra R K,Paul B K.Investigation on percolation in conductance of mixed reversemicelles[J].Colloids and Surfaces,2005(252):243～259

4 Paul B K,Mitra R K.Water solubilization capacity ofmixed reverse micelles:effect of surfactant component,the nature of the oil and electrolyte concentration[J].Colloid and Interface Science,2005(288):261～279.

5 劉海遠(yuǎn)，布冠好，陳復(fù)生，等.超聲波輔助CTAB反膠束萃取大豆蛋白的研究[J]農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011(7)：69.

6 陳復(fù)生，姚永志，磨禮現(xiàn)，等.利用反膠束萃取大豆蛋白同時(shí)酶水解的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2006，21(6):68～70.

7 高艷秀，陳復(fù)生，布冠好，等.超聲波輔助SDS反膠束前萃花生蛋白研究[J].糧食與油脂,2012(7)：15～19.

8 趙曉燕.反膠束萃取大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與特性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

9 高亞輝，陳復(fù)生，張書霞，等.反膠束萃取大豆蛋白前萃過程機(jī)理初探[J].食品與機(jī)械，2009，25(5)：70.

10 Noritomi H,Kojima N,Kato S,et al.How can temperature affect reversemicellar extraction using sucrose fatty acid ester[J].Colloid&Polymer Science,2006(284):683～687.

11 李潤霞，陳復(fù)生，趙俊廷.反膠束萃取技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究[J].食品與機(jī)械，2006，22(5):115～119.