邱倬星 熊學(xué)敏 胡曉艷 熊犇 陳樂 謝玲

[摘要] 目的 建立一種同步測定車前子超微速溶飲片中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷含量的高效液相色譜方法。方法 采用液相色譜法，色譜柱為Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm， 5μm）， 流速：1.0 mL/min， 檢測波長： 254 nm， 柱溫： 30℃。 結(jié)果 京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的線性范圍分別為0.191～1.910μg （r2= 0.999 8）和0.2002～2.002μg（r2=0.999 9）；平均加樣回收率分別為100.1%（RSD=0.57%，n=6）和99.8%（RSD=0.28%，n=6）。結(jié)論 本方法操作簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為該產(chǎn)品質(zhì)控的方法。

[關(guān)鍵詞] 京尼平苷酸；毛蕊花糖苷；高效液相色譜法

[中圖分類號] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）05-41-03

車前子為車前科（Plantaginaceae）植物車前（Plantago asciatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟種子[1]，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功效還具有調(diào)節(jié)血脂和保護(hù)高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的功能[2]。目前關(guān)于車前子中含量測定的報道多集中于多糖，車前子苷及桃葉珊瑚苷[3-4]，而京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的含量的文獻(xiàn)報道甚少[5]。本實驗在對車前子粉末研究的基礎(chǔ)上，采用HPLC法，建立同步測定車前子超微速溶飲片中的京尼平苷酸與毛蕊花糖苷含量的研究，通過試驗證明，由于藥材的超微分化作用，其含量比對應(yīng)的車前子藥材含量要高。

本研究在制備單味中藥超微速溶飲片工藝中，首次將超微粉碎技術(shù)、微波滅菌技術(shù)、真空包裝等新技術(shù)同步運用到中藥飲片的研究及加工領(lǐng)域，將中藥飲片加工成微米級的顆粒飲片，使中藥飲片從內(nèi)在質(zhì)量到外觀包裝都有了新的提高。單味中藥超微速溶飲片，既保留了傳統(tǒng)飲片的特色與優(yōu)勢，又避免了煎煮的麻煩，且節(jié)省藥材、方便服用，是中藥飲片領(lǐng)域的一項創(chuàng)新性工作，這一研制成果對保護(hù)藥材資源，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化具有十分重要的意義。

1 儀器與試藥

島津LC-20AD高效液相色譜儀（LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外檢測器，10μL定量環(huán)），SimplicityTM型超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；Mettller Tkledo AG135雙量程電子天平（1/10萬）；京尼平苷酸對照品（供含量測定用，批號：111828-201102，中國藥品生物制品檢定所供）；毛蕊花糖苷對照品（供含量測定用，批號：111530-200706，中國藥品生物制品檢定所供）；車前子超微速溶飲片（由江西天聚堂中藥飲片有限公司提供，粒度小于50μm，批號：（A1201040815、A1202021533、A1202101891），試驗用甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 C18，250 mm×4.6 mm，5μm（大連依利特公司）；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10μL；流動相A為乙腈：甲醇（10：15），流動相B為0.5%醋酸水溶液（A+B=100%），流動相超聲脫氣，梯度洗脫。見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取京尼平苷酸對照品和毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置同一100 mL的棕色定量瓶中（定量瓶預(yù)先校正），加60%甲醇溶解并定量稀釋制成含京尼平苷酸0.095 5 mg/mL和毛蕊花糖苷0.100 1 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取車前子超微速溶飲片約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放置室溫，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取混和對照品液（按“2.2.1”項下制備）及供試品溶液（按“2.2.2”項下制備）各10μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件，記錄色譜圖（結(jié)果見圖1、圖2）。結(jié)果表明，在此色譜條件下，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的保留時間分別約為5.00 min和25.00 min，分離度良好。理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計算應(yīng)不低于3000，按毛蕊花糖苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.4 線性關(guān)系

分別精密稱取京尼平苷酸對照品9.55 mg與毛蕊花糖苷對照品10.01 mg，分別置25 mL棕色量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得.分別精密吸取上述2種對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置2 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度， 搖勻，作為系列對照品溶液。分別精密吸取上述6份對照品溶液各10μL，按選定色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，京尼平苷酸的回歸方程為Y=13.767X-3103.2，r2=0.999 8；毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=8.5137X-777.60，r2=0.999 9；結(jié)果表明京尼平苷酸在0.191～1.910μg之間線性范圍良好，毛蕊花糖苷在0.2002～2.002μg之間線性范圍良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，按“2.1”項下的方法連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定京尼平苷酸，毛蕊花糖苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.84%、2.01%（n=6），表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批車前子超微速溶飲片（批號：A1202021533）按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算。結(jié)果京尼平苷酸，毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.00%，1.09%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取車前子超微粉末（批號：A1202021533），按“2.2.2”項下平行制備6份供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8h進(jìn)樣測定，記錄京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的峰面積，RSD分別為1.00%，1.09%（n=6），結(jié)果表明，8h內(nèi)供試品溶液中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的車前子超微速溶飲片（A1202021533），分別定量加入京尼平苷酸對照品與毛蕊花糖苷對照品，按“2.2.2”項下制備供試溶液。精密進(jìn)樣10μL。按“2.1”色譜條件測定，計算京尼平苷酸平均回收率為100.1%，RSD值為0.57%；毛蕊花糖苷平均回收率為99.8%，RSD值為0.28%。見表2。

2.9 樣品含量測定

取3批車前子超微速溶飲片約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣記錄峰面積。對照品溶液按“2.2.1”項下方法制備，用外標(biāo)法計算2種成分的含量。3批樣品含量見表3。

3 討論

本實驗如采用2010版藥典一部對應(yīng)車前子藥材項下含量測定[4]的流動相進(jìn)行梯度洗脫，峰形不好，保留時間長，基線漂移現(xiàn)象嚴(yán)重；后分別改用乙腈：甲醇：1%醋酸（10∶15∶75）；乙腈：甲醇：0.1%醋酸（10∶15∶75）；乙腈：甲醇：0.5%磷酸（10∶15∶75）；[流動相A為乙腈，流動相B為水：磷酸（86∶0.1）梯度洗脫]等4種系統(tǒng)作為流動相，前3種系統(tǒng)分離效果均不好，京尼平苷酸出峰時間短，峰形不好；第4種系統(tǒng)的出峰時間比本實驗選擇的流動相出峰時間要長，且京尼平苷酸的分離效果相對要差一點，經(jīng)多次試驗并調(diào)整流動相，最后確定流動相A為乙腈：甲醇（10∶15），流動相B為0.5%醋酸水溶液（A+B=100%）此體系進(jìn)行梯度洗脫，京尼平苷酸和毛蕊花糖苷與相鄰峰得到較好的分離，峰形也較好。

車前子藥材加工成超微速溶飲片后，在相同的提取條件下進(jìn)行含量測定，超微速溶飲片中的各成分含量較藥材中提高，3組車前子超微速溶飲片中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的平均含量分別是0.761%，1.160%；3組車前子藥材中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的平均含量分別是0.742%，1.129%；這說明經(jīng)加工后的超微速溶飲片中有效成分的溶出率有提高。

目前，超微粉碎可供選擇的設(shè)備有很多，常用的超微粉碎設(shè)備有機(jī)械沖擊式粉碎機(jī)，氣流粉碎機(jī)，球磨機(jī)，振動機(jī)，攪拌磨等各種類型[6]。中藥材經(jīng)超微粉碎，可使粉體比表面積和孔隙率增加而具有獨特的物理化學(xué)性能，易于在體內(nèi)吸收利用[7]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：51.

[2]何永婷，朱賀年.車前子的研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué)，2011，8（1）：55-57.

[3] 高明哲，袁呂魯，徐青，等.高效液相色譜法測定大車前子中車前子苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2004，18（增刊）：34-36.

[4] 吳祥松，劉賢旺，黃慧蓮，等.江西道地藥材車前子中桃葉珊瑚苷含量的測定[J].中藥科技，2002，4 （11）：18-20.

[5]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：63.

[6] 王艷艷，王團(tuán)結(jié)，丁琳琳.中藥超微粉碎技術(shù)與裝置研究[J].裝備應(yīng)用與研究，2011，23（8）：35-40.

[7] 蔡光先，楊永華.中藥超微飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化研究[M].湖南科技出版社，2007：1-5.

（收稿日期：2013-01-29）