張玉強(qiáng) 鄭超 楊赟 劉敏 徐麟 符小發(fā)

[摘要] 目的 從31種中草藥醇提物中篩選出具有抗HBV活性的藥物。 方法 60%乙醇回流提取藥物醇提物；用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性；采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的HBsAg和HBeAg；用治療指數(shù)判斷藥物的抗HBV作用。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草等5種中草藥具有一定的抗HBV活性，半數(shù)有毒濃度分別為83.2、926.5、509.9、477.7和577.7 μg/mL；最大無(wú)毒濃度時(shí)，5種藥物對(duì)HBeAg的抑制率分別為52.9%、63.7%、78.1%、56.8%和66.3%，對(duì)HBeAg的半數(shù)抑制濃度為29.7、34.4、42.1、91.4和27.8 μg/mL，治療指數(shù)分別為2.8、26.9、12.1、5.2、20.8。 結(jié)論 檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺和溪黃草抗HBV效果較好，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 中藥提取物；乙型肝炎病毒；HepG2 2.2.15細(xì)胞；HBsAg；HBeAg

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）05-37-05

乙肝病毒（HBV）屬嗜肝DNA病毒，感染HBV后不僅會(huì)引起急、慢性肝炎，而且還可能導(dǎo)致原發(fā)性肝癌[1-2]。在我國(guó)，至少有一半以上的人感染過(guò)乙肝病毒，嚴(yán)重的危害著人民的健康[3]。干擾素與核苷類(lèi)似物是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的抗乙肝藥物，已大量用于治療慢性乙肝。但干擾素副作用較大，而核苷類(lèi)易引起病毒變異，導(dǎo)致治療效果下降[4-5]，因此，研究抗HBV藥物已成為治療乙型肝炎的重中之重。

我國(guó)中草藥資源豐富，實(shí)踐表明許多天然藥物不僅具有明確的治療乙型肝炎的作用，而且毒性低，副反應(yīng)小，從中分離提取活性成分已成為當(dāng)前新型抗乙肝藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。但由于HBV宿主僅限于人和類(lèi)人猿，不適于動(dòng)物模型的建立[6]。為此，Camille等[7]于1986年將HBV基因組轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)G-418篩選得到細(xì)胞克隆，建

立了HepG2 2.2.15細(xì)胞株，已被國(guó)內(nèi)外作為抗乙肝藥物篩選的細(xì)胞模型，大量應(yīng)用于藥物的篩選研究[8-12]，且已經(jīng)成為申報(bào)肝炎新藥必具的抗病毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚13]。

為此，通過(guò)查閱相關(guān)書(shū)籍[14-15]，選取具有治療肝炎、清熱解毒、保肝護(hù)肝等功效的中草藥共31種，以HepG2 2.2.15細(xì)胞為評(píng)價(jià)模型，運(yùn)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法及酶聯(lián)免疫（ELISA）法，檢測(cè)各中草藥提取物的細(xì)胞毒性及對(duì)抗原分泌的抑制率，初步篩選出具有抗HBV活性的藥物。

1 材料

1.1 中草藥

實(shí)驗(yàn)用中草藥購(gòu)自河北安國(guó)聚福中藥材有限公司，藥材名稱(chēng)見(jiàn)表1。

1.2 HepG2 2.2.15細(xì)胞株

HepG2 2.2.15細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)MountSinai醫(yī)學(xué)中心，可穩(wěn)定、持續(xù)的分泌HBsAg、HBeAg，本實(shí)驗(yàn)室自行傳代培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液，青霉素-鏈霉素，胰蛋白酶，胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）；G-418、DMSO（Amresco公司）；MTT（美國(guó)Sigma公司）；HBsAg、HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒（北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司）。

1.4 器材

培養(yǎng)瓶，96孔板（美國(guó)Corning）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 中藥醇提物樣品的制備

取粉碎后藥材，加入60%乙醇，料液比1︰10，回流提取3次，每次2 h，提取液經(jīng)過(guò)濾除渣、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓濃縮后，經(jīng)干燥、研磨得醇提物干粉，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HepG2 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)參考Tianzhen Wang[16]的方法，具體步驟如下：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后，棄培養(yǎng)液，用pH7.2 PBS洗2遍，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化，待細(xì)胞形態(tài)變化并且開(kāi)始脫落時(shí)，棄消化液，加培養(yǎng)液輕輕吹打均勻，1∶4傳代，用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、380 μg/mL G-418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)液均加380 μg/mL G-418）。

2.3 藥物對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞毒性試驗(yàn)

MTT比色法[13，17]檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。按上述方法將細(xì)胞消化吹勻后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔150 μL。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入含有1200，600，300，150，75，37.5，18.8，9.4 μg/mL等不同濃度藥物的培養(yǎng)液，每孔150 μL，各濃度分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組及無(wú)細(xì)胞的空白組。培養(yǎng)72 h后，棄上清，每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT及100 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清后每孔加入150 μL DMSO，震蕩至甲瓚藍(lán)完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下各孔OD值，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞存活率來(lái)判斷藥物對(duì)細(xì)胞毒性的大小。半數(shù)有毒濃度TC50用Reed-Meuench法計(jì)算[18]。

式中：B=log<50%藥物濃度，A=log>50%藥物濃度，C=A-B，下同。

2.4 藥物對(duì)HBeAg分泌的抑制試驗(yàn)

參考王選舉等[19]報(bào)道的方法，略有改動(dòng)。將細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，接種至96孔板種，每孔150 μL。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入無(wú)毒濃度以下2倍稀釋的藥物，每種藥物設(shè)定6個(gè)梯度，每梯度3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定3孔不加藥物的對(duì)照組，4 d后換相同濃度的藥物繼續(xù)培養(yǎng)，藥物作用8 d后收集上清液，-20℃保存。用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中HBsAg及HBeAg，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm時(shí)各孔OD值，結(jié)果以抗原抑制率表示：

2.5 藥物效果評(píng)價(jià)

藥物的安全性及臨床應(yīng)用前景通常以治療指數(shù)（TI）來(lái)評(píng)價(jià)。TI=TC50/IC50，當(dāng)TI>2.0時(shí)為有效低毒，1.02.0時(shí)藥物才有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

3 結(jié)果與討論

3.1 31種中草藥抗乙肝活性的篩選

結(jié)合MTT法及ELISA法檢測(cè)藥物抗乙肝活性的結(jié)果見(jiàn)表1。最大無(wú)毒濃度時(shí)部分中草藥表現(xiàn)出一定的抗乙肝活性，其中檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草5種中草藥在最大無(wú)毒濃度時(shí)具有較好的抑制HBeAg活性，抑制率分別為52.9%、63.7%、78.1%、56.8%、66.3%。紫草、木蝴蝶、狼杷草、怪柳、一枝蒿、阿魏、金不換等中草藥對(duì)HBeAg抑制率為30%～50%，有輕度抑制作用，其它藥物對(duì)HBeAg抑制率<30%。所有藥物對(duì)HBsAg的抑制率均<50%，其中葡萄根和檳榔對(duì)HBsAg抑制率為38%和30.9%，有輕度抑制作用，其它藥物對(duì)HBsAg抑制率均<30%。為此，本實(shí)驗(yàn)選取檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草等5種效果較好藥物繼續(xù)檢測(cè)。

3.2 5種效果較好中草藥對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞的毒性

采用2.3方法，檢測(cè)檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草5種藥物在不同濃度時(shí)對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性并計(jì)算TC50值。結(jié)果表明，檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草的TC50分別為83.2、926.5、509.9、477.7、577.7 μg/mL，其中佛甲草TC50最大，對(duì)細(xì)胞毒性最小，其余依次為溪黃草、石榴皮、駱駝刺和檳榔。見(jiàn)表2。

3.3 5種效果較好中草藥對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞抗原分泌的抑制作用

采用2.4方法檢測(cè)5種藥物對(duì)HepG2 2.2.15細(xì)胞抗原分泌的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草等藥物對(duì)HBeAg分泌的抑制作用呈明顯劑量依賴(lài)關(guān)系，IC50依次為29.7、34.4、42.1、91.4、27.8 μg/mL；但5種中草藥對(duì)HBsAg的抑制作用均較弱，檳榔、佛甲草、石榴皮對(duì)HBsAg的最大抑制率分別為30.9%、28.0%和23.2%，而駱駝刺和溪黃草對(duì)HBsAg的分泌無(wú)抑制作用。

3.4 5種效果較好中草藥抗HBV效果評(píng)價(jià)

檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草等5種中草藥對(duì)HBeAg的治療指數(shù)分別為2.8、26.9、12.1、5.2、20.8，全部>2，均為有效低毒。其中，佛甲草的TI值最高，效果最好，其它依次為溪黃草、石榴皮、駱駝刺和檳榔；由于5種中草藥對(duì)HBsAg抑制率<50%，無(wú)法計(jì)算IC50值，故無(wú)法計(jì)算治療指數(shù)。見(jiàn)表4。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)31種中草藥醇提物的抗HBV活性進(jìn)行了初步篩選研究，結(jié)果顯示，檳榔、佛甲草、石榴皮、駱駝刺、溪黃草5種中草藥對(duì)HBeAg具有較好的抑制作用，而HBeAg是HBV大量復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的一種可溶性蛋白，代表著HBV復(fù)制的強(qiáng)弱，與病毒傳染性正相關(guān)[23-25]，為此，推測(cè)這5種中草藥很可能具有抗乙肝的作用，尤其對(duì)降低或控制乙肝患者的傳染性方面起到一定效果，可進(jìn)一步追蹤分離活性部位或組分。

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（收稿日期：2013-01-15）