龍梅?謝孟峽?劉媛

摘 要 應用熒光光譜方法對丁香酸與魚精DNA的相互作用機理進行研究，當加入魚精DNA后丁香酸的內(nèi)源性熒光發(fā)生明顯猝滅，結(jié)果表明在DNA與丁香酸濃度比在4≤CfsDNA/CSY ≤ 32范圍內(nèi)，計算其stern-volmer 猝滅速率常數(shù)為1.52×1012 L·mol-1·s-1，屬靜態(tài)猝滅機理，說明二者之間形成復合物。根據(jù)靜態(tài)猝滅理論研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合丁香酸與DNA之間的結(jié)合比為1：1，常數(shù)為K fsDNA/SY = 1.85×104 L·mol-1，二者結(jié)合使得丁香酸分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變。

關(guān)鍵詞 熒光猝滅 魚精DNA 丁香酸

引 言

DNA作為生物遺傳物質(zhì)，是生物體內(nèi)主要的生物大分子之一，同時也是眾多藥物的主要標靶。藥物進入體內(nèi)后與DNA的相互作用，會影響DNA本身的復制和合成等性質(zhì)，因而小分子藥物與DNA相互作用研究近年來越來越受到人們重視[[1，2]。有機酸是中藥中的一大類有效成份，同時也廣泛分布在植物、水果和蔬菜中，它們與生物大分子的相互作用日益受到關(guān)注[3～5]。Sroka[6]等研究多酚酸的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)羥基數(shù)多的多酚酸抗氧化活性要大于羥基數(shù)少的多酚酸。丁香酸屬于苯甲酸衍生物，經(jīng)常在板藍根等一些植物的提取液中找到，具有消炎、抗菌、抗氧化等作用[7]。

圖1 丁香酸 syringic acid

對小分子藥物與DNA相互作用的研究近年來已經(jīng)成為生物、化學等眾多領(lǐng)域的研究熱點問題之一，該領(lǐng)域的研究有助于人們從分子水平認識藥物DNA相互作用方式，對于研究小分子的生物活性及藥物作用機理、對以DNA為靶標的藥物分子篩選和設(shè)計等都有重要意義。本文通過熒光光譜法研究丁香酸和魚精DNA的相互作用，判定二者相互作用形成復合物，并計算出結(jié)合常數(shù)，為從分子水平認識丁香酸與DNA的相互作用提供重要信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀，法國JY公司 Fluorolog-TAU-3 熒光光譜儀。

試劑：魚精DNA（Fish sperm DNA，fsDNA）（北京鼎國生物技術(shù)有限公司，Sigma公司分裝）；丁香酸（純度≥97%）（sigma公司）； NaH2PO4（北京紅星化工廠，分析純）；NaOH（分析純，北京化學試劑公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。

溶液配制：配置0.02 mol?L-1NaH2PO4緩沖液溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.4，所有的魚精DNA和丁香酸溶液均用該緩沖溶液配置。熒光光譜測量中魚精DNA的濃度以ε260 = 6600L?mol-1?cm-1確定[8]，測定二者相互作用光譜時保持丁香酸濃度為10-5mol?L-1；加入DNA溶液和藥物具有一系列濃度比例，C fsDNA /C藥物依次為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0。

1.2 實驗內(nèi)容

熒光光譜測量：以280nm為激發(fā)波長，記錄300～500nm范圍內(nèi)丁香酸及其與一系列不同濃度fsDNA混合溶液的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁香酸與DNA相互作用前后的熒光光譜特征

通常情況下丁香酸的紫外吸收光譜在190-350nm范圍內(nèi)主要有3個吸收帶，位于190-230nm處的強吸收帶屬于K吸收帶，位于230-270nm處的較弱吸收帶是B吸收帶，以及位于270-310nm處的較弱吸收帶屬于R吸收帶。K吸收帶的波長、強度與共軛體系的數(shù)目、位置、取代基的種類有關(guān)。從結(jié)構(gòu)上看，由于有助色團-OH、-OCH3的影響，SY在204-210nm吸收峰是苯骨架結(jié)構(gòu)E2和K的合并吸收帶；受溶劑磷酸緩沖液極性和取代基的影響，SY的B吸收帶精細結(jié)構(gòu)消失，形成一個寬峰；溶劑極性大使n→π*吸收帶藍移，助色團-OH、-OCH3使吸收帶紅移，兩種作用的影響使SY的R吸收帶消失，與B吸收帶合并成一個寬峰。

DNA分子具有吸收250–280nm波長紫外光的特性，其吸收峰值在260nm左右，在280nm處吸收值很小，對于丁香酸本身的熒光發(fā)射幾乎不造成干擾。因此選擇DNA做猝滅劑，以280nm為熒光激發(fā)波長，通過丁香酸熒光發(fā)射峰的變化可以研究DNA與藥物的相互作用。

pH 7.4的磷酸緩沖液中，280nm激發(fā)波長下，丁香酸在351nm處有較強的熒光發(fā)射峰。魚精DNA（fsDNA）的紫外光譜的最大吸收在260nm左右，在280nm激發(fā)波長下，在370nm左右有弱的熒光發(fā)射峰（見圖1）。當藥物分子與fsDNA發(fā)生相互作用時，藥物熒光發(fā)射強度被明顯的猝滅，其猝滅程度隨fsDNA濃度的增加而增大（見圖1）。這種藥物熒光發(fā)射峰的強度被DNA明顯猝滅的現(xiàn)象能夠直觀地說明二者之間發(fā)生了相互作用。但是這種相互作用，僅僅是由于分子間碰撞引起的靜態(tài)猝滅，還是二者之間發(fā)生相互結(jié)合而引起的動態(tài)猝滅，這還需要進一步研究驗證。

2.2 DNA對藥物的熒光猝滅參數(shù)研究

2.2.1 速率常數(shù) 熒光猝滅的機制有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅之分，通過判定猝滅機制可以明確地判定出藥物與DNA分子之間是否發(fā)生了相互的結(jié)合，對于研究藥物小分子與生物大分子之間的相互作用機制具有重要的意義。一般來說各類猝滅劑對熒光發(fā)色團的最大動態(tài)擴散猝滅常數(shù)kQ為2.0×1010 L?mol-1?s-1，如果kQ小于該猝滅常數(shù)，則猝滅機理主要是動態(tài)猝滅；當kQ大于該猝滅常數(shù)，說明猝滅機理包括靜態(tài)猝滅[9]。如果kQ大于最大動態(tài)擴散常數(shù)2-3個數(shù)量級，則主要為靜態(tài)猝滅機理。

如果熒光分子與猝滅劑之間發(fā)生的是動態(tài)猝滅，那么它們應該服從Stern-Volmer方程[10]：

（1）

其中F0、F分別藥物與猝滅劑作用前后的熒光強度，[Q]為猝滅劑濃度，τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命，KQ為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，KD為Stern-Volmer常數(shù)。從方程可以看出，用猝滅劑濃度[Q]對F0/F作圖應該成線性，根據(jù)直線的斜率即可計算出KD，進而可以計算得到熒光猝滅速率常數(shù)KQ。

根據(jù)Stern-Volmer方程，計算出丁香酸與fsDNA相互作用的猝滅速率常數(shù)。從圖2中看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)0/F與fsDNA濃度[Q]之間并不完全呈線性關(guān)系，在較高濃度時向上彎曲。首先在4≤C fsDNA /CSY≤32范圍內(nèi)二者是直線關(guān)系，根據(jù)直線的斜率可以計算出fsDNA對SY的熒光猝滅速率常數(shù)為1.52×1012L?mol-1?s-1，遠遠大于動態(tài)猝滅的最大擴散猝滅常數(shù)2.0×1010 L?mol-1?s-1，說明在該濃度范圍內(nèi)，fsDNA對丁香酸的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅機理，也就是說此時fsDNA與藥物分子之間相互結(jié)合形成了不發(fā)熒光的基態(tài)復合物。當fsDNA濃度進一步升高時，Stern-Volmer曲線向上彎曲，說明此時fsDNA對丁香酸的熒光猝滅已經(jīng)不符合動態(tài)猝滅機理，這是因為任何化學反應中反應物之間都存在特定的比例，而fsDNA的濃度已經(jīng)大大超出二者結(jié)合的比例，在其對丁香酸的熒光猝滅中除動態(tài)猝滅還存在諸如靜態(tài)猝滅、非輻射能量轉(zhuǎn)移等多種猝滅機理共存。

2.2.2 結(jié)合常數(shù) 從上文的分析中可以看到，在4≤C fsDNA /CSY≤32濃度范圍內(nèi)，fsDNA對丁香酸的熒光猝滅符合靜態(tài)猝滅機理，根據(jù)靜態(tài)猝滅理論[11]即

（2）

以lg（（F0-F）/F）對lg[Q]作圖，便可求得藥物與fsDNA分子的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合數(shù)n。

丁香酸與fsDNA的結(jié)合位點數(shù)通過lg（F0-F/F）=lgKa+nlg[Q]進行線性回歸，見圖3，根據(jù)直線斜率計算可得n=1.15（R=0.995），n近似為1說明丁香酸與fsDNA堿基之間形成1：1的復合物。同時根據(jù)圖3中直線的截距，計算丁香酸與fsDNA之間的結(jié)合常數(shù)K fsDNA/SY = 1.85×104 L?mol-1。

圖4 丁香酸熒光猝死雙導數(shù)曲線

注：λex=280nm，T=25℃.

通過熒光猝滅光譜、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)可以揭示熒光發(fā)色基團與DNA相互作用的方式。從圖2中仔細觀察可以看到，fsDNA不僅使SY的熒光強度發(fā)生猝滅，而且熒光發(fā)射峰也有紅移現(xiàn)象，說明在fsDNA作用下，二者結(jié)合使得SY的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這可能是藥物與fsDNA之間發(fā)生嵌插結(jié)合的結(jié)果。fsDNA有A-DNA的結(jié)構(gòu)特征，在其雙螺旋鏈上有深而狹的大溝和寬而淺的小溝；其在生理pH值的條件下帶有大量負電荷，在溶液中的DNA分子內(nèi)也有一部分氫鍵被打開，而且打開的部位處于不斷的變化之中，堿基對氫鍵上的質(zhì)子也會不斷地與介質(zhì)中的質(zhì)子發(fā)生交換。丁香酸分子中-COOH上面的H+與fsDNA中的負電荷結(jié)合進而嵌插到fsDNA寬而淺的小溝中，并進一步與堿基對氫鍵上的質(zhì)子發(fā)生交換，形成復合物有較大的平面結(jié)構(gòu)，導致熒光吸收峰紅移。

3 結(jié)論

通過fsDNA與丁香酸分子的熒光猝滅研究發(fā)現(xiàn)，在二者的濃度比例低于32范圍內(nèi)，該猝滅過程主要是靜態(tài)猝滅機理，二者之間能過發(fā)生相互作用，形成1：1復合物，計算所得結(jié)合常數(shù)K fsDNA/SY = 1.85×104 L?mol-1。在丁香酸的熒光猝滅同時，其熒光發(fā)射峰還發(fā)生一定的紅移，說明丁香酸分子有可能嵌入fsDNA分子的小溝中，使得其分子結(jié)構(gòu)平面性加大。當fsDNA濃度進一步增加，二者濃度比超出32之后，其對于緩沖液中丁香酸的熒光猝滅機理變得更為復雜，多種猝滅機理共存。

參考文獻

[1] 胡亞敏，王興明，費丹， 等. 熒光光譜法研究核黃素與鯡魚DNA的相互作用[J]. 化學學報，2008，10（66）：1245-1251.

[2] 周慶華，楊頻. 1，3-雙（2-苯并咪唑基）-2-氧雜丙烷與鋅配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其與DNA作用方式的研究[J]. 化學學報，2006，64：793-798.

[3] 龍梅，謝孟峽，劉媛. 熒光法研究咖啡酸及其衍生物與溶菌酶的相互作用[J]. 北京師范大學學報（自然科學版），2010，12，46（6）：704-707.

[4] Koshihara Y， Neichi T， Murota S. Caffeic acid is a selective inhibit or for leukotriene biosyntheisi [J]. Biochim Biophys Acta， 1984，792： 92-97.

[5] 張蓉，李淑賢，崔礪，等. 紫莖澤蘭中綠原酸提取工藝的研究[J]. 北京師范大學學報（自然科學版），2008，44（6）：610-613.

[6] Sroka Z，Cisowski W， Hydrogen peroxide scavenging， antioxidant and anti-radical activity of some phenolic acids[J]. Food and Chemical Toxicology，2003，41（6）： 753-758.

[7] 劉云海，方建國，貢雪芃，等. 板藍根中丁香酸的抗內(nèi)毒素作用[J]. 中草藥，2003，10（34）：65-67.

[8] Xie MX，Xu XY， Wang YD. Interaction between hesperetin and human serum albumin revealed by spectroscopic methods[J]. Biochim. Biophys. Acta ， 2005， 1724： 215-224.

[9] Xie MX， Long， M， Liu， Y， et al. Characterization of the interaction between human serum albumin and morin[J]. Biochim. Biophys. Acta， 2006， 1760：1184-1191.

[10] 王東冬， 孟慶翔， 陳丹丹， 等. 光譜法研究EGCG—Cu（Ⅱ）與ctDNA的相互作用[J]. 光譜學與光譜分析，2007 ， 27（3） ： 510-513.

[11] 謝孟峽，蔣敏，李崧，等. β-1，2，3，4，6-O-倍酰-D-葡萄糖與人血清白蛋白的相互作用研究[J]. 化學學報，2004， 62： 1460-1466.