洪瀾 朱根海 王圣坦 蔡俊宏

[摘要]目的 探討卵巢上皮癌細(xì)胞OVCAR-3培養(yǎng)的影響因素，提高培養(yǎng)的成功率。 方法 按培養(yǎng)條件分為：未濾菌加抗菌素組、濾菌加抗菌素組、濾菌不加抗菌素組及改良復(fù)蘇組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞裸鼠皮下種植，觀察成瘤率并行組織學(xué)檢查。 結(jié)果 未濾菌加抗菌素組，復(fù)蘇培養(yǎng)5次，全部失??；濾菌加抗菌素組，復(fù)蘇培養(yǎng)10次，全部成功；濾菌不加抗菌素組，復(fù)蘇培養(yǎng)10次，失敗4次，成功率60%；改良復(fù)蘇組：復(fù)蘇培養(yǎng)10次，全部成功。種植后2周出現(xiàn)瘤體，各組成瘤率100%，各組腫瘤組織學(xué)檢查未見明顯差異。 結(jié)論 無菌操作是OVCAR-3最重要的影響因素，濾菌及加用抗菌素是關(guān)鍵步驟。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞培養(yǎng)；卵巢上皮癌細(xì)胞株

[中圖分類號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）05-28-03

卵巢上皮癌細(xì)胞培養(yǎng)是卵巢癌臨床與基礎(chǔ)研究的基本技術(shù)，其成功與否直接影響到卵巢癌研究的進(jìn)程和質(zhì)量。卵巢上皮癌細(xì)胞株種類較多，OVCAR-3是近年來使用比較多的卵巢上皮癌細(xì)胞株[1]，本研究通過對(duì)其培養(yǎng)成功和失敗的總結(jié)，分析其影響因素，以期達(dá)到提高培養(yǎng)成功率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)試劑 人卵巢上皮癌OVCAR3細(xì)胞株（American type culture Collection，ATCC）（Manassas， VA），胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液（Invitrogen，CA）。胰酶、二甲基亞砜（DMSO），青霉素和鏈霉素溶液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（BB16UV，德國(guó)Heraeus公司），超凈工作臺(tái)（VS-1300L型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司），倒置相差光學(xué)顯微鏡（IX71型，Olympus），恒溫水浴鍋（DZW-4型，金壇市恒豐儀器廠）。

1.1.3 雌性BALB/c裸鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鼠齡4～6周，體重15 ～ 17 g；SPF（special pathogen free）級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，飼料及鋪墊物均經(jīng)過滅菌處理，所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人及各種用品均經(jīng)過嚴(yán)格的微生物控制。

1.2 方法

1.2.1 在不同的條件下進(jìn)行培養(yǎng) （1）未濾菌加抗菌素組：所有試劑均未使用濾菌膜過濾，每10毫升培養(yǎng)液中加入20 μL濃度為200 U/mL的青霉素和鏈霉素溶液， 共復(fù)蘇培養(yǎng)5次。（2）濾菌加抗菌素組：胎牛血清及培養(yǎng)液使用0.22μm及0.45μm濾菌膜過濾[2]，并加入20μL濃度為200 U/mL的抗菌素液，共復(fù)蘇培養(yǎng)10次。（3）濾菌不加抗菌素組：胎牛血清使用0.22μm及0.45μm濾菌膜過濾，不加抗菌素液，共復(fù)蘇培養(yǎng)10次。（4）改良復(fù)蘇組：以上各組均采用傳統(tǒng)方法復(fù)蘇[3]，細(xì)胞復(fù)蘇后加入10 mL培養(yǎng)液洗滌低速離心，棄上清液再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，本組指細(xì)胞復(fù)蘇后直接加入培養(yǎng)液10 mL進(jìn)行培養(yǎng)，第2天換液，共復(fù)蘇培養(yǎng)10次。

1.2.2 具體方法 按以上方法復(fù)蘇后隔兩天換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，每次換液保留1/3原培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本鋪滿瓶底80%左右進(jìn)行傳代，吸凈培養(yǎng)液加入0.25%的胰酶溶液2 mL消化2 min使之脫壁游離，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液7 mL洗滌并低速離心，棄上清液，重復(fù)兩次，再加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液6 mL吹打成細(xì)胞懸液，按1∶3的傳代方式分置3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)補(bǔ)足培養(yǎng)液至10 mL，于37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞凍存方法： 配置凍存液，95%的原細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)液及5%的DMSO，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、低速離心并棄上清液后用合適量的凍存液吹打成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×106/mL，按每份0.5 mL分裝于冷凍管中，標(biāo)記封口后先放入4℃冰箱10 min，轉(zhuǎn)入-20℃放置30 min，再移置-80℃冰箱16～18 h或過夜，最后取出放入液氮罐中貯存。

1.2.3 皮下種植及腫瘤組織學(xué)檢查[4] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OVCAR-3 細(xì)胞以0.25%的胰酶消化后， 加入不含胎牛血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，離心后重懸于PBS 溶液中，制備2×106 /0.1 mL細(xì)胞懸液，0.2 mL/只接種至裸小鼠的頸背部近腋窩處皮下，取瘤體行病理活檢（HE染色），以上各組培養(yǎng)成功后各皮下種植5只。

2 結(jié)果

（1）未濾菌加抗菌素組：復(fù)蘇培養(yǎng)5次，全部失敗。（2）濾菌加抗菌素組：復(fù)蘇培養(yǎng)10次，全部成功。（3）濾菌不加抗菌素組：復(fù)蘇培養(yǎng)10次，失敗4次。（4）改良復(fù)蘇組：復(fù)蘇培養(yǎng)10次，全部成功。

種植后2周出現(xiàn)瘤體，各組成瘤率100%，2個(gè)月解剖取瘤組織活檢示腫瘤細(xì)胞形狀大小不一，體積增大，核大深染，核分裂較多，各組腫瘤組織學(xué)檢查未見明顯差異。見圖1～2。

3 討論

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)受很多因素影響，包括細(xì)胞株的選擇、凍存條件、化學(xué)藥品的殘留、物理損傷及各種污染控制等[5]，其中最重要的是污染控制，還要考慮的是細(xì)胞培養(yǎng)基外加成分如抗菌素等對(duì)細(xì)胞特性是否有影響。

3.1 培養(yǎng)液是否需要濾菌器除菌

濾過的主要目的是清除雜質(zhì)及病原體，培養(yǎng)液配制過程都是無菌條件下進(jìn)行，也沒有雜質(zhì)，生產(chǎn)過程中已經(jīng)反復(fù)濾菌處理，理論上不需進(jìn)一步過濾，但配制過程涉及很多環(huán)節(jié)，很難保證某些環(huán)節(jié)不受污染，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，培養(yǎng)液未經(jīng)濾菌器處理的細(xì)胞培養(yǎng)均失敗。一般采用0.45μm 及0.22μm濾菌器雙層過濾。最終配制好的培養(yǎng)液包括胎牛血清均需過濾，過濾后分裝凍存?zhèn)溆?。很多使用者認(rèn)為過濾繁瑣，且說明書上并未注明必須過濾除菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，因此濾菌器除菌是細(xì)胞培養(yǎng)非常重要的環(huán)節(jié)。

3.2 細(xì)胞復(fù)蘇后是否需要洗滌細(xì)胞

傳統(tǒng)方法細(xì)胞復(fù)蘇后需要多次低速離心洗滌細(xì)胞以去除DMSO，但很多研究者認(rèn)為DMSO在加入培養(yǎng)液稀釋后濃度較低，對(duì)細(xì)胞造成的影響很小，況且離心可能會(huì)增加污染的機(jī)會(huì)并對(duì)對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞造成一定的損傷，所以建議省略洗滌細(xì)胞這一步[6-7]。本組研究結(jié)果提示兩種方法都可以，改良的方法更簡(jiǎn)單，操作更方便，改良培養(yǎng)法應(yīng)該在第2天細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液以清除殘存的DMSO。

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液是否要加抗菌素或其他助生長(zhǎng)劑

上皮細(xì)胞培養(yǎng)受諸多條件限制[8]，一般要加抗菌素或其他試劑促細(xì)胞生長(zhǎng)[9]，腫瘤細(xì)胞抵抗力較強(qiáng)，生長(zhǎng)很快，有研究者認(rèn)為可以不加包括抗菌素在內(nèi)的其他附加藥物，該細(xì)胞株的出品地ATCC的培養(yǎng)說明中也沒有建議加抗菌素，但不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的條件都能控制到理想狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不可避免受到各種病原體的污染[10]，本研究結(jié)果亦提示不加抗菌素培養(yǎng)失敗率較高，或者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，因此加抗菌素有利于細(xì)胞培養(yǎng)。還有些作者認(rèn)為加用層粘連蛋白 α2有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]，對(duì)于卵巢癌細(xì)胞株是否需要加入助生長(zhǎng)劑目前尚未見報(bào)道，本研究認(rèn)為只要沒有病原體污染，細(xì)胞生長(zhǎng)完全能滿足研究的需要，不需加助生長(zhǎng)劑。雖然卵巢上皮癌細(xì)胞比較容易培養(yǎng)，但仍需一定的技術(shù)條件[12]，其中就包括抗菌素的應(yīng)用，使用的抗菌素為青霉素和鏈霉素混合溶液，使用濃度為200 U/mL，抗菌素的使用有兩種方法，一種是和培養(yǎng)液配制時(shí)一起加入，分裝備用，另一種是在培養(yǎng)時(shí)把抗菌素直接加入至培養(yǎng)皿中，因抗菌素在培養(yǎng)液中保存時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)失效，所以目前多采用在培養(yǎng)皿中直接加入。

3.4 不同的培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞特性是否有影響

本組研究還提示無論是傳統(tǒng)的復(fù)蘇方法還是改良的復(fù)蘇方法，或是否加用抗菌素，只要細(xì)胞能正常傳代，其接種裸鼠后成瘤率及細(xì)胞特性都沒有變化，因此改良的復(fù)蘇方法及加用抗菌素對(duì)細(xì)胞特性沒有影響，可以作為腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)常規(guī)。

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（收稿日期：2013-01-14）