丁曉

摘要：對(duì)66株豬多殺性巴氏桿菌的鑒定結(jié)果表明，PCR是一種快速、特異、靈敏的病原檢測(cè)方法。應(yīng)用能夠擴(kuò)增大多數(shù)原核生物16S rRNA基因的通用引物，對(duì)豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S基因rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期為分子水平上準(zhǔn)確地鑒別豬巴氏桿菌提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌；16S rRNA；PCR

中圖分類號(hào)：S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）05-0005-02

多殺性巴氏桿菌是一種廣泛存在的感染致病菌，在我國規(guī)?；B(yǎng)殖場常有染病和發(fā)病。目前，在獸醫(yī)臨床上對(duì)該病的確診仍普遍采用傳統(tǒng)的病原分離方法，即通過對(duì)細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)分離，然后從形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征以及免疫學(xué)特性等方面加以鑒別，以確定細(xì)菌的種屬和血清型。雖然這種方法能取得可靠的鑒定結(jié)果，但存在操作繁瑣，耗時(shí)長等不足。近年來，唐先春等[1]建立了豬多殺性巴氏桿菌的PCR檢測(cè)方法，對(duì)66株多殺性巴氏桿菌的鑒定結(jié)果表明，PCR檢測(cè)是一種快速、特異、靈敏的病原檢測(cè)方法。管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法對(duì)禽多殺性巴氏桿菌的分離株及我國的代表性疫苗株進(jìn)行了鑒定研究，結(jié)果表明2株分離菌與對(duì)照的強(qiáng)弱毒株之間的同源性為100%。

該試驗(yàn)應(yīng)用能夠擴(kuò)增大多數(shù)原核生物16S rRNA基因的通用引物，對(duì)豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期為分子水平上準(zhǔn)確地鑒別豬巴氏桿菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Premix-Taq酶和DNA Marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、無菌操作臺(tái)、電泳儀及紫外分析儀、PCR儀。

1.3 培養(yǎng)基

血清肉湯：稱取營養(yǎng)瓊脂粉末33 g加入1 000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝高壓滅菌（121 ℃，30 min）后，冷卻到50～60 ℃，按3%的比例加入新生小牛血清，低溫保藏備用。

血液瓊脂平板：稱取營養(yǎng)瓊脂粉末33 g加入 1 000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝，高壓滅菌（121 ℃，30 min）后，冷卻到50～60 ℃，按5%～6%的比例加入無菌脫脂纖維兔鮮血，然后制成平板低溫保藏備用。

麥康凱瓊脂平板：稱取麥康凱瓊脂粉末33 g加入1 000 mL蒸餾水，加熱至全部溶解，121 ℃高壓滅菌30 min后，制成平板，低溫保藏備用。

1.4 菌株來源

豬巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)疫苗株（EO630），為廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)所提供。

豬巴氏桿菌野外分離株，為佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 基因組DNA的抽提

將血液瓊脂培養(yǎng)基上的野外分離株用無菌生理鹽水制成的細(xì)菌洗液和豬巴氏桿菌疫苗株，用UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒抽提細(xì)菌基因組DNA。操作步驟如下：

（1）取200 μL制備好的樣品，加入400 μL Digestion Buffer混勻，再加入3 μL Proteinase K混勻，55 ℃保溫5～10 min。

（2）加入200 μL無水乙醇混勻，然后用1 mL Tip 頭將樣品全部轉(zhuǎn)移到套放于2 mL 收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中。

（3） 8 000 r/min室溫離心1 min。

（4） 取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液，將柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solition，10 000 r/min，室溫離心30 s。

（5）重復(fù)步驟（4）一次。

（6）取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液，將柱放回收集管中，10 000 r/min，室溫離心15 s，以除去殘留Wash Solution。

（7） 將柱放入新的潔凈1.5 mL離心管中，在柱中央加入50 μL Elution Buffer，室溫放置2 min。

（8）10 000 r/min，室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組DNA。樣品可以4 ℃或～20 ℃保存。

1.6 引物

使用能夠擴(kuò)增大多數(shù)原核生物16S rRNA 基因序列的通用引物，該引物同時(shí)能夠擴(kuò)增出豬附紅細(xì)胞體和貓血巴爾通氏體的16S rRNA基因序列。引物由上海博亞公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

下游引物：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.7 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系的總體積為50 μL，其中Premix-Taq 酶25 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各1μL，模板為5 μL ，然后加dd H2O至50 μL 。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性10 min；94℃變性3 min，50 ℃退火1 min ，72 ℃延伸2 min ，32個(gè)循壞；最后72 ℃延伸7 min。陽性對(duì)照為鏈球菌疫苗株，以蒸餾水為陰性對(duì)照。其他反應(yīng)程序同上。取10 μL PCR 產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射臺(tái)上觀察。

1.8 PCR產(chǎn)物的測(cè)序

將試驗(yàn)獲得的兩株豬巴氏桿菌PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.9 序列同源性分析

進(jìn)入Internet登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）站點(diǎn)后，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，將序列與GenBank中已知的各種微生物序列進(jìn)行相似性搜索，尋找同源核苷酸序列，確定其種類。采用DNAssist軟件的多序列比對(duì)程序?qū)υ囼?yàn)獲得的疫苗株和分離株的序列進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的分離鑒定結(jié)果

分離株在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落形態(tài)均為露珠狀、邊緣整齊、有光澤的灰色圓形菌落，無溶血現(xiàn)象。在血清肉湯中培養(yǎng)，開始輕度渾濁，4～6 d后液體變清朗，管底出現(xiàn)粘稠沉淀，振搖后不分散，表面形成菌環(huán)。鏡檢觀察形態(tài)一致，為球桿狀或短桿狀菌，兩端鈍圓、無鞭毛、不形成芽孢、兩極著色、革蘭氏染色陰性。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從豬巴氏桿菌的分離株和疫苗株中抽提細(xì)菌基因組DNA，用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出大小約為1.5 kb的DNA片段，以鏈球菌疫苗株為陽性對(duì)照的PCR擴(kuò)增，也得到了相似的條帶。以蒸餾水為陰性對(duì)照沒有出現(xiàn)特異性條帶。

2.3 PCR測(cè)序結(jié)果

經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，獲得豬巴氏桿菌疫苗株和野外分離株16S rRNA 基因核苷酸序列。

2.4 同源性分析

接入Internet進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）站點(diǎn)，利用“Nucleotide-nucleotide BLASTn”程序，將序列與GenBank中已知的各種微生物序列進(jìn)行相似性搜索，尋找同源核苷酸序列，BLASTn結(jié)果顯示，試驗(yàn)所獲得的巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的序列與GenBank中多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因序列同源性最高，達(dá)98%。用DNAssist軟件的多序列比對(duì)程序試驗(yàn)獲得的疫苗株和分離株的對(duì)試序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，豬多殺性巴氏桿菌疫苗株（EO630）和野外分離株的16S rRNA基因的同源性為達(dá)97.5%。

3 小結(jié)與討論

（1）多殺性巴氏桿菌野外分離株經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗(yàn)可以初步斷定為多殺性巴氏桿菌，該試驗(yàn)對(duì)多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株用試劑盒抽提基因組DNA，按照試驗(yàn)使用的引物和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果證明，試驗(yàn)建立的PCR擴(kuò)增方法能成功地?cái)U(kuò)增出巴氏桿菌的16S rRNA基因，適合于進(jìn)行多殺性巴氏桿菌的分子鑒定。

（2）多殺性巴氏桿菌是豬肺疫的病原菌。豬肺疫是一種危害嚴(yán)重的疾病，死亡率較高。該病主要引起成年豬的急性敗血癥，有時(shí)也可導(dǎo)致慢性呼吸道癥狀，致使豬群生長緩慢，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。

rRNA按沉降系數(shù)分3種，分別為5S、16S和23S。16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中，其基因序列由保守區(qū)和可變區(qū)組成，兩者互相交錯(cuò)排列。編碼rRNA基因與細(xì)菌整個(gè)基因組的變化相比，有高度的保守性?，F(xiàn)有細(xì)菌其祖先的某些痕跡仍留在其核苷酸序列中，這種痕跡為細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了可能。因此，有人將rRNA稱為細(xì)菌的“化石”[3]。16S rRNA基因是目前最常被選用的分類鑒定基因，不同科、屬、種間的細(xì)菌16Sr RNA基因同源性可達(dá)97%以上[4]。

管宇等[2]成功地利用16S rRNA基因序列分析方法對(duì)禽多殺性巴氏桿菌的分離株及我國的代表性疫苗株進(jìn)行了鑒定研究，結(jié)果表明2株分離菌與對(duì)照的強(qiáng)弱毒株之間的同源性為100%。本試驗(yàn)只進(jìn)行了2個(gè)豬多殺性巴氏桿菌株的16S rRNA基因的序列分析，雖然結(jié)果不能進(jìn)一步揭示2株巴氏桿菌是否為同一個(gè)亞種，但從結(jié)果可以看出，豬多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的16S rRNA基因的同源性為97.5%，說明豬多殺性巴氏桿菌疫苗株和野外分離株的16S rRNA基因存在一定差異。

（3）試驗(yàn)測(cè)定的豬多殺性巴氏桿菌疫苗株是目前廣東豬群廣泛使用的弱毒菌株，由于16S rRNA基因是一個(gè)具有高度保守性的基因，疫苗株和野外分離株之間16S rRNA基因序列的差異提示，疫苗株和野外流行的部分毒株之間的遺傳特性存在著一定程度的差異，這種差異是否能解釋豬多殺性巴氏桿菌疫苗免疫接種以后，在某些豬群仍然有豬肺疫病的散發(fā)，尚需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 唐先春，吳 斌，陳煥春.豬多殺性巴氏桿菌PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技，2004，34（2）：46-48.

[2] 管 宇，沈志強(qiáng)，劉吉山，等.應(yīng)用16S rRNA基因測(cè)序法鑒定禽多殺性巴氏桿菌的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：349-352.

[3] 騰懿群.16S rRNA基因?qū)?xì)菌感染的分子生物學(xué)研究[J].國外醫(yī)學(xué)流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè)，1997，24（4）：60-63

[4] JONAS D，ROSENBAUM A，WEYRICH S，et al.Enzyme linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of Legionella in bronchoalveolar fluid[J]. J Clin Microbiol，1995，33（5）：1247-1257.