慕慶峰

摘 要：隨著科技的不斷發(fā)展，在環(huán)境微生物學(xué)中熒光原位雜交技術(shù)被越來越廣泛的應(yīng)用。FISH技術(shù)是利用有熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針和細(xì)胞中相應(yīng)的DNA相結(jié)合的方法，來達(dá)到檢測和鑒定微生物的目的。這項(xiàng)技術(shù)是當(dāng)前環(huán)境科學(xué)界研究的熱點(diǎn)，本文就對熒光原位雜交技術(shù)在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用和進(jìn)展進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞：熒光原位雜交技術(shù)； 環(huán)境微生物學(xué)； 應(yīng)用和進(jìn)展

中圖分類號：Q93-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-3315（2013）07-135-001

近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得微生物學(xué)領(lǐng)域的研究發(fā)生了很大的變革，借助分子生物學(xué)方法來進(jìn)行微生物的鑒定和檢測成為了現(xiàn)代微生物診斷以及生態(tài)學(xué)研究的重要手段。FISH技術(shù)是一種將分子生物學(xué)精確性、顯微鏡可視性的特點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合的技術(shù)，它也可以對微生物群落來進(jìn)行評價?，F(xiàn)在FISH技術(shù)已經(jīng)被很廣泛的應(yīng)用于環(huán)境微生物學(xué)中了，主要用于揭示微生物原位生理學(xué)功能和特性。

一、熒光原位雜交技術(shù)概述

（一）原理

熒光原位雜交技術(shù)是將核糖體內(nèi)中高度保守、長度適中的16SrRNA序列來作為理想的基因分類靶序列，然后根據(jù)這個序列的特異性、保守性來設(shè)計(jì)所需的不同級別和分類的寡核苷酸探針，并且對特意核苷酸序列中帶標(biāo)記的RNA或者DNA分子進(jìn)行識別，這個探針和待檢測的靶DNA是同源互補(bǔ)的，經(jīng)過變性、退火、復(fù)性的過程來形成核酸探針和靶DNA的雜交體。這種技術(shù)所使用的寡核苷酸探針是經(jīng)過了熒光標(biāo)記的約為20bp的特異性核苷酸片段，并利用這報(bào)告分子和熒光素標(biāo)記具有的特意親和素間的免疫化學(xué)反應(yīng)，通過熒光檢測系統(tǒng)來對要被檢測的DNA進(jìn)行定位、定性和定量的分析。

（二）特點(diǎn)

作為一種非放射性的檢測系統(tǒng)，F(xiàn)ISH技術(shù)有其特有的屬性和優(yōu)點(diǎn)：

1.FISH是一種非放射性的檢測系統(tǒng)，采用的是生物素標(biāo)記探針，避免了輻射性污染；

2.熒光探針具有穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性，每進(jìn)行一次標(biāo)記就可以在兩年之內(nèi)進(jìn)行使用，并且在一般的具有熒光顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行使用；

3.FISH技術(shù)基于抗原鑒特異性識別和結(jié)合的特點(diǎn)，具有特異性好、定位準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)周期短以及靈敏度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且進(jìn)行長度為1kbDNA序列的定位時，其靈敏度是和放射性探針不相上下的；

4.多色的FISH可以同時進(jìn)行多種DNA序列的檢測，可以應(yīng)用的范圍是十分廣泛的。

（三）步驟

熒光原位雜交技術(shù)的操作步驟主要有七項(xiàng)，即1.樣品固定；2.樣品預(yù)處理；3.樣品預(yù)雜交；4.樣品和探針變性；5.雜交；6.漂洗去除沒有結(jié)合的探針；7.對雜交信號進(jìn)行檢測。

二、熒光原位雜交在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用

（一）對環(huán)境微生物多樣性的診斷

FISH對于環(huán)境微生物多樣性的診斷是其在環(huán)境微生物學(xué)中比較具有代表性的應(yīng)用。環(huán)境微生物研究方式主要是純培養(yǎng)，但是環(huán)境微生物種類眾多，只有很小的一部分能夠被培養(yǎng)，所以這種方式會使其多樣性分析產(chǎn)生的結(jié)果具有局限性，有研究人員發(fā)現(xiàn)在不同的環(huán)境微生物研究中99%以上的微生物種類是不能夠被培養(yǎng)的。熒光原位雜交技術(shù)能夠?qū)⑽⑸锃h(huán)境中的完整細(xì)胞景象信息進(jìn)行再現(xiàn)還愿，精確度較高，因此在現(xiàn)在的微生物多樣性的研究領(lǐng)域中被廣泛的應(yīng)用。FISH技術(shù)在近幾年中，對于自然環(huán)境微生物群落的研究成果比較明顯，有對海水沉積物群落的研究結(jié)果，也有海水、河水、高山湖雪水中的浮游菌體、根系表面以及土壤之中的寄居群落。熒光原位雜交技術(shù)不僅可以提供微生物在某一時刻的景象信息，還能夠檢測生物環(huán)境中微生物群落以及其種群動態(tài)。與此同時，F(xiàn)ISH技術(shù)還被應(yīng)用于鑒定和檢測沒有培養(yǎng)出來的種屬和新種屬，例如酸桿菌屬、巨大硫酸鹽細(xì)菌、全噬菌屬等。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為探究自然菌群生態(tài)學(xué)組成和群落對于自然、人為因素的動態(tài)變化的答應(yīng)研究最有利的一種科技手段了。

（二）對硝化細(xì)菌的研究

氨氧化菌和硝化菌的數(shù)量以及其空間分布式和微生物在硝化、反硝化的過程中所處階段是相關(guān)聯(lián)的，由此可見，對于生物處理系統(tǒng)中的硝化菌、氨氧化菌進(jìn)行的研究是調(diào)控廢水脫氮工藝想要正常運(yùn)行的重要參數(shù)。傳統(tǒng)的研究方式步驟過多，有分離、富集、分類、鑒定等，會耗費(fèi)很多時間，這主要是因?yàn)橄趸?xì)菌在生理上是一種十分特殊的化能自氧菌。FISH技術(shù)能夠解決這類問題，在很早之前就有研究者將這一技術(shù)引入到了硝化細(xì)菌檢測中，建立起了一套比較完善的硝化細(xì)菌的FISH檢測法。隨著時代發(fā)展和科技的進(jìn)步，人工設(shè)計(jì)合成的硝化細(xì)菌、氨氧化菌探針不斷地被研究出來，F(xiàn)ISH技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用到了活性污泥系統(tǒng)以及消化流化床反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器等的污水處理系統(tǒng)中去了。

綜上所述，熒光原位雜交在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用是十分廣泛的，這項(xiàng)技術(shù)對于微生物種類多樣性的研究以及處理三廢都有很重要的意義。但是，F(xiàn)ISH技術(shù)在應(yīng)用中仍存在一些問題，隨著研究的不斷深入和不斷完善，這些問題必將被解決，熒光原位雜交技術(shù)對于環(huán)境微生物學(xué)一定會有更加重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

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