李瑤 王雷 付玉杰

摘要：利用從加拿大引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小球藻（Chlorella vulgaris）制備微藻油脂，探討影響小球藻生長(zhǎng)的條件，如培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度等，以期獲得脂肪酸組成以C16和C18為主的藻株及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，將轉(zhuǎn)基因小球藻接種在氮磷質(zhì)量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養(yǎng)基中，在28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，最終可得到生產(chǎn)狀況較好、生長(zhǎng)速度較快的小球藻。

關(guān)鍵詞：小球藻（Chlorella vulgaris）；微藻油脂；脂肪酸；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：TK6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）08-1905-03

隨著全世界石油資源日漸枯竭，人類面臨著能源缺乏的危機(jī)，同時(shí)，人類環(huán)境保護(hù)意識(shí)日漸增強(qiáng)，已逐漸認(rèn)識(shí)到以石油為燃料會(huì)造成嚴(yán)重的空氣污染，危害人類的身體健康[1]。而且石油燃燒產(chǎn)生的CO2會(huì)導(dǎo)致溫室效應(yīng)，破壞地球的生態(tài)平衡[2]。研究表明，生物柴油是最具有發(fā)展前途的柴油機(jī)替代燃料，是最重要的清潔燃料之一[3]。生物柴油是指以水生植物油脂、動(dòng)物油脂等為主要原料，在催化劑的作用下通過(guò)可再生的動(dòng)植物油與低碳醇酯交換制成的一種性質(zhì)與石化柴油非常相似的燃油[4]。生物柴油既可以單獨(dú)作為燃料使用，也可以與石化柴油調(diào)和使用?；旌先剂喜坏軌蚋纳撇裼蜋C(jī)的排放特性[5]，還可以提高柴油的潤(rùn)滑性。生物柴油作為可再生能源，可緩解人類社會(huì)對(duì)石油的依賴；對(duì)環(huán)境友好，大大降低柴油機(jī)對(duì)空氣的污染；燃點(diǎn)高于石化柴油，處理、運(yùn)輸、使用和貯藏都變得更加安全和便利。自從1981年南非首次提出生物柴油這一概念后，世界各國(guó)都十分關(guān)注這種“綠色能源”?，F(xiàn)在許多國(guó)家都已經(jīng)開展了生物柴油的研制和生產(chǎn)[6]。

小球藻（Chlorella vulgaris）含有豐富的脂類，是制備生物柴油的重要原料。小球藻的光合作用效率高、生長(zhǎng)周期短、生物產(chǎn)量高，而且環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)。小球藻是一種單細(xì)胞綠藻。改變小球藻培養(yǎng)基的化學(xué)成分可以使它的生長(zhǎng)方式發(fā)生改變，由此提高小球藻的生長(zhǎng)效率、獲得高含量脂肪，并且有利于小球藻細(xì)胞內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物（如脂類）的積累，降低生產(chǎn)成本[7]。本研究從加拿大引進(jìn)了轉(zhuǎn)基因小球藻，它的脂肪酸主要組成為C16和C18脂肪酸，且以C16∶0、C16∶1、C18∶1為主，即雙鍵數(shù)目通常為一個(gè)，從結(jié)構(gòu)上分析是理想的柴油替代品[8]。本研究探討影響小球藻生長(zhǎng)的條件，優(yōu)化利用轉(zhuǎn)基因小球藻制備微藻油脂的培養(yǎng)條件，為利用小球藻制備生物柴油打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 供試小球藻藻種購(gòu)自加拿大滑鐵盧大學(xué)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）GM培養(yǎng)基（1 L）：1.8 g尿素，1.25 g KH2PO4，1.00 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

2）SC培養(yǎng)基（1 L）：1.25 g KNO3，1.25 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0.5 g EDTA，0.114 2 g H3BO4，0.111 g CaCl2·2H2O，0.049 8 g FeSO4·7H2O，0.088 2 g ZnSO4·7H2O，0.014 2 g MnCl2·4H2O，0.015 7 g CuSO4·5H2O，0.004 9 g Co（NO3）2·6H2O。

取GM培養(yǎng)基與SC培養(yǎng)基按比例混合制成GM-SC培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基氮磷質(zhì)量比的優(yōu)化 向培養(yǎng)基添加尿素、KH2PO4調(diào)至氮磷質(zhì)量比（尿素KH2PO4的質(zhì)量比）為1∶1、3∶2、4∶3和2∶1，并滅菌備用。在超凈工作臺(tái)中將轉(zhuǎn)基因小球藻藻種分別接種在4種氮磷質(zhì)量比的GM-SC培養(yǎng)基中，并做好標(biāo)記。將已接種小球藻的錐形瓶置于恒溫振蕩箱中，溫度調(diào)節(jié)到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養(yǎng)。定期測(cè)定其在600 nm下的吸光度，重復(fù)3次，取平均值。用OD600 nm變化來(lái)表示小球藻的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化 采用最佳氮磷質(zhì)量比的培養(yǎng)基配方，用0.5 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)至培養(yǎng)基pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在超凈工作臺(tái)中將轉(zhuǎn)基因小球藻藻種分別接種在6種pH的GM-SC培養(yǎng)基中，并做好標(biāo)記。將已接種的錐形瓶放置于恒溫振蕩箱中，溫度調(diào)節(jié)到30 ℃，光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min振蕩培養(yǎng)。定期測(cè)定其在600 nm下的吸光度，3次重復(fù)，取平均值。用OD600 nm變化來(lái)表示小球藻的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 將小球藻藻種接種到最適宜條件的培養(yǎng)基中，分別在26、28、30、32 ℃光照16 h、黑暗處理8 h，以120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，定期測(cè)定其在600 nm下的吸光度，3次重復(fù)，取平均值。用OD600 nm變化來(lái)表示小球藻的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 脂肪酸的檢測(cè) 優(yōu)化條件后，在最佳條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻，并委托農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸和硬脂酸）占總脂肪酸的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基氮磷質(zhì)量比對(duì)轉(zhuǎn)基因小球藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)基中氮磷質(zhì)量比為4∶3時(shí)，轉(zhuǎn)基因小球藻的生長(zhǎng)狀況較好；而當(dāng)?shù)踪|(zhì)量比為2∶1時(shí)，轉(zhuǎn)基因小球藻的生長(zhǎng)狀況較差。所以，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜的氮磷質(zhì)量比為4∶3。

2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)轉(zhuǎn)基因小球藻生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，這種轉(zhuǎn)基因小球藻比較適宜在堿性環(huán)境下生長(zhǎng)，在pH 8.5～9.0的條件下，轉(zhuǎn)基因小球藻生長(zhǎng)較好。在酸性條件下（pH 6.5～7.0），轉(zhuǎn)基因小球藻生長(zhǎng)狀況較差。所以，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜培養(yǎng)基的pH為8.5。

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)基因小球藻生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，轉(zhuǎn)基因小球藻在28 ℃的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)狀況最好，30 ℃的培養(yǎng)條件次之。由此可知，在試驗(yàn)的范圍之內(nèi)，最適宜的培養(yǎng)溫度為28 ℃。

2.4 脂肪酸檢測(cè)結(jié)果

委托農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因小球藻的C16和C18脂肪酸（亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸等）占總脂肪酸的比例，結(jié)果見表1?？梢奀18脂肪酸含量較高，C16脂肪酸含量一般，用該小球藻制備微藻油脂相對(duì)比較滿意。

3 小結(jié)

利用從加拿大引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小球藻進(jìn)行試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：將轉(zhuǎn)基因小球藻接種在氮磷質(zhì)量比為4∶3、pH 8.5的GM-SC培養(yǎng)基中，在28 ℃的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最終可得到生產(chǎn)狀況較好、生長(zhǎng)速度較快的小球藻。試驗(yàn)優(yōu)化了利用轉(zhuǎn)基因小球藻制備微藻油脂的條件，為利用小球藻制備生物柴油打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 譚天偉，王 芳，鄧 立，等.生物柴油的生產(chǎn)和應(yīng)用[J].現(xiàn)代化工，2002，22（2）：4-6.

[2] SHAY E G. Diesel fuel from vegetable oils； status and opportunities[J]. Biomass Bioenergy，1993，4（4）：227-242.

[3] 盛 梅，鄔國(guó)英，徐 鴿.生物柴油的制備[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2004，18（2）：231-236.

[4] 汪向陽(yáng)，陳金思，徐玉福，等.棉籽油生物柴油和柴油混合燃料的潤(rùn)滑特性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（3）：272-276.

[5] 李小昱，韓鶴友，王 為，等.柴油機(jī)應(yīng)用不同配比生物柴油的經(jīng)濟(jì)性和排放特性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25（5）：177-182.

[6] 王一平，翟 怡，張金利.生物柴油制備方法研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2003，22（1）：8-12.

[7] 繆曉玲，吳慶余.微藻油脂制備生物柴油的研究[J].太陽(yáng)能學(xué)報(bào)，2007，28（2）：220-222.

[8] 王 銘，劉 然，徐 寧，等.13種微藻的脂肪酸組成分析[J].生態(tài)科學(xué)，2006，25（6）：542-544.