徐玲玲　陳習(xí)　易立等

摘 要：以不同分叉和同一分叉不同高度的千層塔原植物為材料，采用超聲波輔助提取后利用高效液相色譜法對(duì)不同類別千層塔中石杉?jí)A甲含量進(jìn)行快速測(cè)定。結(jié)果顯示，石杉?jí)A甲的含量表現(xiàn)為葉片>莖>根部；分叉越多、植株越高，石杉?jí)A甲含量越高；三分叉以上、相對(duì)比較高的千層塔植株石杉?jí)A甲含量較高，是野外千層塔原藥材采收的最佳類型。

關(guān)鍵詞：千層塔；形態(tài)；分叉；石杉?jí)A甲；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）09-0036-03

千層塔（Huperzia serrata）為石杉科石杉屬植物蛇足石杉的干燥全草，始載于《植物名實(shí)圖考》，性味辛、苦、平，具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效[1]。1972年我國科技工作者報(bào)道了從該植物中分離的石杉?jí)A甲具有橫紋肌松弛作用[2]，之后大量研究發(fā)現(xiàn)石杉?jí)A甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑[3]。由于千層塔所具有的顯著醫(yī)療作用和潛在的市場效益，1993年美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)石杉?jí)A甲片屬類膽堿能劑，現(xiàn)已被國際上列為第二代乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑之一[4]。隨著老齡化社會(huì)的到來，老年癡呆和記憶障礙成為臨床迫切需要解決的問題[5]，石杉?jí)A甲作為新型AChE抑制劑應(yīng)用前景十分廣闊，對(duì)千層塔的研究也受到了越來越多的關(guān)注[6]。

但是，野生千層塔生長緩慢[7]，當(dāng)?shù)厝嗽诓墒諘r(shí)完全是“見者誅殺”，無論大小，走過之處，基本上無一生還。這樣的采收，不僅導(dǎo)致采集的原藥材質(zhì)量良莠不齊，而且導(dǎo)致這一本身生長緩慢、數(shù)量不多的藥用植物處于瀕危的邊緣。因此，給當(dāng)?shù)厮幟裉峁┮粋€(gè)合理、適時(shí)采收千層塔的依據(jù)非常重要。本研究在千層塔快速檢測(cè)工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)不同形態(tài)野生千層塔中石杉?jí)A甲的含量進(jìn)行測(cè)定、對(duì)比，從藥材質(zhì)量的角度提出合理采收千層塔的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 千層塔采于湖北恩施市盛家壩鄉(xiāng)麻茶溝村龍?zhí)翜辖M（34.2696576°N，109.1914236°E），由中國科學(xué)院植物研究所標(biāo)本室鑒定為蛇足石杉（Huperzia serrata）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 KQ-500VDE臺(tái)式三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，容量22.5 L，超聲頻率45 kHz，超聲功率500 W，功率可調(diào)（40%～100%），時(shí)間可調(diào)（1～480 min）；Waters Alliance高效液相色譜儀；電子天平，北京賽多利斯天平儀器廠。

1.1.3 試劑 石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100243-200401）；乙腈、甲醇為色譜純（進(jìn)口），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將采集的千層塔先用自來水沖洗掉表面附著物，然后按照不同的分叉數(shù)、同一分叉數(shù)按照不同的株高（5～10、10～15、15～20 cm）進(jìn)行分類，用剪刀分離葉片、莖段和根，標(biāo)記。將不同類別的材料放入烘箱（60℃）干燥至恒重。取出，研磨，過60目篩，備用。

1.2.2 待測(cè)樣液制備 精確稱取一定量的不同類型的千層塔粉末，加入2%酒石酸，放入超聲清洗儀進(jìn)行超聲提取。超聲完成后，用濾紙過濾至50 ml容量瓶，用2%酒石酸溶液定容，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液進(jìn)行色譜測(cè)定。

1.2.3 超聲提取時(shí)間的確定 精確稱取一定量的三分叉千層塔葉片粉末6份，加入2%酒石酸，1份靜置過夜作為對(duì)照，其余5份進(jìn)行超聲提取，超聲時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4 h。然后按照1.2.2的方法進(jìn)行處理，HPLC測(cè)定，以確定石杉?jí)A甲提取的最佳超聲時(shí)間。

1.2.4 色譜條件 C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇+0.08 mol/L醋酸銨溶液（V/V=32∶8，用冰醋酸調(diào)pH至6.0）；流速1 ml/min；檢測(cè)波長308 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μl。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取石杉?jí)A甲對(duì)照品10 mg，甲醇溶解后定容至100 ml，然后用甲醇配制成5、10、20、40、80、100 mg/L的對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20 μl，以峰面積與對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=6592.23654X+5.8330173，r=0.9993。

1.2.6 樣液測(cè)定 按上述色譜條件，量取20 μl樣液進(jìn)樣，記錄峰面積，按線性回歸方程計(jì)算石杉?jí)A甲的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)千層塔中石杉?jí)A甲提取的影響

由表1可知，超聲提取3 h，從三分叉千層塔葉片中測(cè)得的石杉?jí)A甲含量最高，因此確定超聲處理時(shí)間為3 h。

2.2 千層塔葉片、莖和根部石杉?jí)A甲的含量比較

結(jié)果（表2）表明，對(duì)于三分叉的千層塔植株，葉片中石杉?jí)A甲的含量最高，莖中次之，根部的石杉?jí)A甲含量遠(yuǎn)低于葉片和莖中。

2.3 千層塔不同分叉數(shù)對(duì)石杉?jí)A甲含量的影響

由表3可知，隨著千層塔植株分叉數(shù)量的增多，葉片和莖中的石杉?jí)A甲含量也隨之增高，三分叉以上的植株中石杉?jí)A甲的含量差異不大。

2.4 千層塔植株高度對(duì)石杉?jí)A甲含量的影響

3 結(jié)論與討論

超聲波提取法的操作簡單、成本低、效果好[8， 9]，但對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的具體操作過程而言又不完全相同。本試驗(yàn)通過比較不同的超聲處理時(shí)間對(duì)千層塔中石杉?jí)A甲含量的影響，確定最佳的超聲處理時(shí)間為3 h，此時(shí)石杉?jí)A甲提取率達(dá)到最大。在此基礎(chǔ)上對(duì)不同分叉數(shù)、不同株高千層塔植株中石杉?jí)A甲含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，分叉越多、植株越高，其石杉?jí)A甲的含量越高，多于三分叉的植株其石杉?jí)A甲含量差別不大；千層塔地上部分的石杉?jí)A甲含量明顯高于地下部分，這與孫遠(yuǎn)明等[10]的研究結(jié)果一致。

因此，在千層塔的實(shí)際采收過程中應(yīng)該遵循：（1）選擇三分叉以上的高植株，不要采收分叉較少的植株；（2）盡可能不采挖根部，除因根部的石杉?jí)A甲含量很低外，千層塔還可通過根部不定芽的形式進(jìn)行自然繁殖。這對(duì)千層塔資源的保護(hù)性開發(fā)具有非常重要的指導(dǎo)意義。

參 考 文 獻(xiàn)：

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