賈 旺 劉 曉 魯潤春 賈桂軍 倪 明 孫 靜 徐志卿

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

垂體腺瘤是顱內(nèi)常見的良性腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤的發(fā)生率中僅次于膠質(zhì)瘤和腦膜瘤，占顱內(nèi)腫瘤總數(shù)的15%［1］。垂體腺瘤的生長過程中部分病例會出現(xiàn)腫瘤內(nèi)出血，稱作腫瘤卒中。垂體腺瘤卒中發(fā)生的時(shí)間和程度差異很大，輕微者沒有臨床癥狀，嚴(yán)重者可以造成患者迅速失明。卒中的發(fā)生與腫瘤的血管生成能力關(guān)系密切。血管內(nèi)皮生長因子(vascu-lar endothelial growth factor，VEGF)通過其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)發(fā)揮血管生成作用，可能與垂體瘤卒中的生物學(xué)行為有關(guān)。本研究通過定量PCR檢測垂體腺瘤中最普遍的促血管生成VEGF剪接變體VEGF165及其受體的表達(dá)水平，以探討VEGF及其受體與垂體腺瘤卒中發(fā)生之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本取自2011年3月至2012年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院術(shù)后病理證實(shí)為垂體腺瘤的患者，總共166例，標(biāo)本取自腫瘤接近中心部位，每份標(biāo)本質(zhì)量約為5 g?；仡櫫送暾牟∈?、術(shù)前內(nèi)分泌化驗(yàn)，磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)影像資料則用來評估腫瘤大小、囊變、出血。腫瘤大小依靠MRI增強(qiáng)像上腫瘤的最大直徑判斷;腫瘤囊變定義為T1WI(T1 weighted image)低或等信號，T2WI(T2 weighted image)高信號;腫瘤出血定義為T1WI等信號，T2WI低信號或T1WI高信號，T2WI低或高信號;(圖1)。

圖1 MRI顯示垂體腺瘤卒中及囊變Fig.1 MRI images of intratumor hemorrhage and cystic lesions of pituitary adenomas

1.2 標(biāo)本收集并反轉(zhuǎn)錄為cDNA

手術(shù)切除腫瘤組織后立即置入液氮中保存。按照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒流程提取RNA，－80℃保存。SuperscriptⅢ First－Strand Synthesis System for RT－PCR試劑盒流程將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃保存。

1.3 Real-time PCR

QPCR反應(yīng)體系(SYBGreen):采用SYBR Green法，試劑為SYBR Green mixture(美國ABI公司)。每個(gè)反應(yīng)體系 ddH2O 8 μL 、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、cDNA 1 μL 、SYBGreen 10 μL，總共 20 μL，每個(gè)樣本重復(fù)3次。循環(huán)條件:50℃ 2 min，95℃ 8 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)，40℃ 30 s。采用Roche LightCycler?480Ⅱ系統(tǒng)的分析功能，把GAPDH設(shè)定為內(nèi)參，得出RQ值反應(yīng)mRNA相對表達(dá)量。引物序列詳見表1。

表1 QPCR引物序列Tab.1 Primers used in the present study

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本文主要指標(biāo)為計(jì)量資料，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性條件時(shí)，采用t檢驗(yàn)或方差分析;不符合正態(tài)性條件時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn);對VEGF及其受體的RQ值行正態(tài)性檢驗(yàn)(P＜0.10)，均不符合正態(tài)分布。計(jì)量數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M(P25，P75)］表示，組間行非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF及其受體表達(dá)與患者年齡、性別的關(guān)系

本組入選病例166例，平均年齡45.4(19～74)歲;＜45歲者79例(47.6%)，≥45歲者87例(52.4%)，組間VEGF及其受體表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。男性83例(50.0%)，女性83例(50.0%)，組間VEGF及其受體表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表2。

2.2 VEGF及其受體表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系

腫瘤最大直徑1～2cm的小腺瘤組30例(18.1%)，2～3 cm的大腺瘤組66例(39.7%)，大于3cm的巨大腺瘤組70例(42.2%)，組間VEGF及其受體表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。

2.3 VEGF及其受體表達(dá)與腫瘤內(nèi)部囊變的關(guān)系

腫瘤磁共振檢查未見囊變組86例(51.8%)，灶狀囊變組 42例(25.3%)，顯著囊變組 38例(22.9%)，組間VEGF及其受體表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。

表2 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3表達(dá)水平與年齡和性別的關(guān)系Tab.2 Age and gender of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

表3 VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3表達(dá)水平與臨床表現(xiàn)信息表Tab.3 Clinical information of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

2.4 VEGF及其受體表達(dá)與腫瘤卒中的關(guān)系

腫瘤影像學(xué)檢查及術(shù)中證實(shí)腫瘤內(nèi)無出血組132例(79.5%)，出血組34例(20.5%)，組間VEGF及其受體表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在96例無功能腺瘤組，無出血組77例(80.2%)，出血組19例(19.8%)，VEGF、VEGFR-3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047，P=0.026)，VEGFR-1的表達(dá)接近有意義的結(jié)果，而VEGFR-2的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。

3 討論

垂體腺瘤內(nèi)部的出血稱為垂體腺瘤卒中，發(fā)生率為1.5% 到27.7%，是其他顱內(nèi)腫瘤的5.4倍［2-3］。垂體腺瘤內(nèi)部的出血也可以不出現(xiàn)癥狀或癥狀輕微，僅在常規(guī)行CT或MRI檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，稱之為亞臨床卒中，在垂體巨大腺瘤中發(fā)生率約為14%～22%，明顯高于小腫瘤［4-5］。腫瘤內(nèi)部迅速而大量的出血稱為垂體腺瘤急性卒中，可以引起腫瘤體積短時(shí)間內(nèi)快速增長，壓迫視交叉并刺激鞍區(qū)附近的硬腦膜，造成患者出現(xiàn)突然而劇烈的頭痛、視力障礙、眼肌麻痹，是垂體腺瘤嚴(yán)重的合并癥。垂體腺瘤急性卒中的流行病學(xué)發(fā)生率約為5%，而術(shù)中證實(shí)卒中發(fā)生率約為2%［6］。

垂體腺瘤卒中在垂體腺瘤的生長過程中出現(xiàn)時(shí)間早晚和出血量差異很大，部分腫瘤體積較小卻出現(xiàn)了比較明顯的卒中，而有些腫瘤體積很大卻不出現(xiàn)腫瘤內(nèi)部的出血，或者僅僅出現(xiàn)灶狀出血。臨床中還可以觀察到少數(shù)病例出現(xiàn)腫瘤比較完全的卒中后腫瘤消失。垂體腺瘤卒中出現(xiàn)生物學(xué)行為差異的原因尚未明確。

腫瘤內(nèi)部的出血與新生血管的生成和腫瘤的生長狀態(tài)有關(guān)，垂體腺瘤也不例外。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的血管生成因子中VEGF被認(rèn)為是最重要的一種［7-8］。對于VEGF在腫瘤中的作用，既往研究［9-12］對于VEGF與垂體腺瘤的腫瘤內(nèi)出血、囊變、腫瘤侵襲及內(nèi)分泌分型等方面存在著不同的意見。VEGF受體的功能也是研究的熱點(diǎn)，VEGFR-1在正常垂體組織的內(nèi)分泌細(xì)胞及垂體腺瘤上皮細(xì)胞表達(dá)，在MtT-S細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，VEGF通過VEGFR-1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生;VEGFR-2表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，與腫瘤血管生成密切相關(guān)，且認(rèn)為VEGF對正常垂體內(nèi)血管完整性及通透性的調(diào)節(jié)有重要作用，通過其受體VEGFR-2及neuropilin-1 NRP-1 協(xié)同完成［13］。既往研究［14-16］顯示，垂體腺瘤的血管化程度較正常垂體組織差，臨床中腫瘤生長亦較緩慢，但垂體腺瘤組織中受體 VEGFR-1及VEGFR-2的表達(dá)相比正常垂體組織卻明顯增高［13，17-18］。

Arita等［9］(2004)報(bào)道垂體腺瘤中VEGF的過度表達(dá)引起血管通透性增加，促進(jìn)水分滲出及囊腫形成，導(dǎo)致腺瘤內(nèi)部壓力增加，而垂體腺瘤血液的供應(yīng)部分來自于垂體門脈系統(tǒng)，即使輕微的壓力增加亦可部分阻斷腫瘤的血流灌注，繼而引起腫瘤的壞死出血，之后的一些研究［9，16，19-21］得出了類似的結(jié)論，但也有一些報(bào)道否認(rèn)它們之間存在聯(lián)系，如Kong等［22］檢測了垂體腺瘤外周血中VEGF的表達(dá)，亦沒有得到有意義的結(jié)果。Jin Kim等［23］用RT-PCR技術(shù)檢測88例垂體腺瘤標(biāo)本的VEGF表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)水平增高與垂體腺瘤卒中相關(guān)，并認(rèn)為通過檢測其表達(dá)可以預(yù)測垂體腺瘤卒中的發(fā)生。

本研究總共166例標(biāo)本，其中無出血組132例(79.5%)，出血組 34例(20.5%)。兩組間比較VEGF及其受體的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步按照內(nèi)分泌功能分組后，卻發(fā)現(xiàn)了有意義的結(jié)果。在本組研究中，無功能腺瘤 96例，占全部病例的57.8%，其中無出血組77例(80.2%)，出血組19例(19.8%)，出血比例與全組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但VEGF及其受體VEGFR-3的表達(dá)在腫瘤卒中病例中明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，VEGF-1的表達(dá)雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表達(dá)水平明顯降低，而VEGFR-2則無明顯變化。由于腫瘤內(nèi)部的囊變也與腫瘤內(nèi)部的血管通透性變化及出血后的吸收機(jī)化有關(guān)，尤其是具有快速視力下降和劇烈頭痛病史沒有及時(shí)就醫(yī)，而磁共振檢查顯示腫瘤內(nèi)部有明顯囊變的病例，本研究認(rèn)為也是腫瘤卒中的自然轉(zhuǎn)歸。本組腫瘤囊性變的病例分組差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也與卒中組的統(tǒng)計(jì)分析一致。

無功能腺瘤在垂體腺瘤中最常見，因而最具有代表性。在垂體腺瘤中，血管的完整性及通透功能需要正常水平VEGF維持［9，13］，在VEGF表達(dá)水平下降時(shí)，血管正常功能受到影響，引起血管破裂出血，而受體VEGFR-1及VEGFR-3的表達(dá)明顯下降表明出血后腫瘤的增生能力降低。與血管生成相關(guān)的受體VEGFR-2的表達(dá)水平未見明顯變化也從反面證實(shí)腫瘤的卒中出血不是由于內(nèi)部的新生血管過度增生引起，這一點(diǎn)作為良性腫瘤的垂體腺瘤與其他高度惡性的腫瘤卒中出血的機(jī)制可能有所不同。因此，本研究認(rèn)為無功能腺瘤卒中的原因與VEGF表達(dá)水平顯著下調(diào)，血管不能維持其正常功能有關(guān)。

與既往的研究［12，24-27］相比，本研究病例數(shù)充足，分組統(tǒng)計(jì)詳盡，同時(shí)對VEGF及3個(gè)受體亞型進(jìn)行檢測，特別是運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測，克服了既往定性或半定量研究手段的缺點(diǎn)，結(jié)果可信度更高。本研究證實(shí)無功能垂體腺瘤的VEGF及VEGFR-3的表達(dá)下降與腫瘤卒中有關(guān)，但其上游調(diào)節(jié)機(jī)制和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)對調(diào)控的反應(yīng)還有待將來進(jìn)一步研究。

［1］Wang C C.Wang Chungcheng’s neurosurgery［M］.Wuhan:Hubei Science and Technology Publishing Company，2005:620-638.

［2］Wakai S，Yamakawa K，Manaka S，et al.Spontaneous intracranial hemorrhage caused by brain tumor:its incidence and clinical significance［J］.Neurosurgery，1982，10(4):437-444.

［3］Wakai S，F(xiàn)ukushima T，Teramoto A，et al.Pituitary apoplexy:its incidence and clinical significance(author's transl)［J］.No to shinkei，1981，33(3):561-568.

［4］Findling J W，Tyrrell J B，Aron D C，et al.Silent pituitary apoplexy:subclinical infarction of an adrenocorticotropinproducing pituitary adenoma［J］.J Clin Endocrinol Metab，1981，52(1):95-97.

［5］Ostrov S G，Quencer R M，Hoffman J C，et al.Hemorrhage within pituitary adenomas:how often associated with pituitary apoplexy syndrome?［J］.AJR Am J Roentgenol，1989，153(1):153-160.

［6］Nawar R N，AbdelMannan D，Selman W R，et al.Pituitary tumor apoplexy:a review［J］.J Intensive Care Med，2008，23(2):75-90.

［7］Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9(6):653-660.

［8］Ferrara N.Vascular endothelial growth factor:basic science and clinical progress［J］.Endocr Rev，2004，25(4):581-611.

［9］Arita K，Kurisu K，Tominaga A，et al.Relationship between intratumoral hemorrhage and overexpression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in pituitary adenoma［J］.Hiroshima J Med Sci，2004，53(2):23-27.

［10］ Fukui S，Nawashiro H，Otani N，et al.Vascular endothelial growth factor expression in pituitary adenomas［J］.Acta Neurochir(suppl)，2003，86:519-521.

［11］ Yarman S，Kurtulmus N，Canbolat A，et al.Expression of Ki-67，P 53 and vascular endothelial growth factor(VEGF)concomitantly in growth hormone-secreting pituitary adenomas;which one has a role in tumor behavior?［J］.Neuro Endocrinol Lett，2010，31(6):823-828.

［12］ Niveiro M，Aranda F I，Peiro G，et al.Immunohistochemical analysis of tumor angiogenic factors in human pituitary adenomas［J］.Hum Pathol，2005，36(10):1090-1095.

［13］Onofri C，Theodoropoulou M，Losa M，et al.Localization of vascular endothelial growth factor(VEGF)receptors in normal and adenomatous pituitaries:detection of a non-endothelial function of VEGF in pituitary tumours［J］.J Endocrinol，2006，191(1):249-261.

［14］ Pizarro C B，Oliveira M C，Pereira-Lima J F，et al.Evaluation of angiogenesis in 77 pituitary adenomas using endoglin as a marker［J］.Neuropathology，2009，29(1):40-44.

［15］Gorczyca W，Hardy J.Microadenomas of the human pituitary and their vascularization［J］.Neurosurgery，1988，22(1Pt1):1-6.

［16］ Turner H E，Harris A L，Melmed S，et al.Angiogenesis in endocrine tumors［J］.Endocr Rev，2003，24(5):600-632.

［17］ Lee J S，Park Y S，Kwon J T，et al.Radiological apoplexy and its correlation with acute clinical presentation，angiogenesis and tumor microvascular density in pituitary adenomas［J］.J Korean Neurosurg Soc，2011，50(4):281-287.

［18］ McCabe C J，Boelaert K，Tannahill L A，et al.Vascular endothelial growth factor，its receptor KDR/Flk-1，and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors［J］.J Clin Endocrinol Metab，2002，87(9):4238-4244.

［19］ Murad-Kejbou S，Eggenberger E.Pituitary apoplexy:evaluation，management，and prognosis［J］.Curr Opin Ophthalmol，2009，20(6):456-461.

［20］ Cheng S Y，Nagane M，Huang H S，et al.Intracerebral tumor-associated hemorrhage caused by overexpression of the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF121 and VEGF165 but not VEGF189［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(22):12081-12087.

［21］ Jung S，Moon K S，Jung T Y，et al.Possible pathophysiological role of vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinase(MMPs)in metastatic brain tumor-associated intracerebral hemorrhage［J］.J Neurooncol，2006，76(3):257-263.

［22］ Kong Y G，Ren Z Y，Su C B，et al.Expressive level of vascular endothelial growth factor in peripheral blood in patients with pituitary adenomas［J］.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2004，26(2):164-167.

［23］ Jin Kim Y，Hyun Kim C，Hwan Cheong J，et al.Relationship between expression of vascular endothelial growth factor and intratumoral hemorrhage in human pituitary adenomas［J］.Tumori，2011，97(5):639-646.

［24］ Cohen A B，Lessell S.Angiogenesis and pituitary tumors［J］.Semin Ophthamol，2009，24(3):185-189.

［25］ Onofri C，Losa M，Uhl E，et al.Immunohistochemical analysis of VEGF-C/VEGFR-3 system and lymphatic vessel extent in normal and adenomatous human pituitary tissues［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2008，116(3):152-157.

［26］ Cristina C，Perez-Millan M I，Luque G，et al.VEGF and CD31 association in pituitary adenomas［J］.Endocr Pathol，2010，21(3):154-160.

［27］ Xiao Z，Liu Q，Mao F，et al.TNF-α-Induced VEGF and MMP-9 expression promotes hemorrhagic transformation in pituitary adenomas［J］.Int J Mol Sci，2011，12(6):4165-4179.