胡 家 鄭 帥 胡 科 殷愛紅*

(1.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，北京100069;3.首都師范大學生命科學學院細胞生物學系，北京100048)

蛋白質是生命功能的執(zhí)行者，但大多數(shù)蛋白質并不能單獨行使其功能，而是通過與其他蛋白質相互作用來參與細胞或組織的生理活動［1］。蛋白質組學研究的轟轟烈烈興起開啟了人們解析各種生命活動以及生理功能的新思路，近些年已經由比較蛋白質組學研究逐漸過渡到功能蛋白質組學研究。構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡能展示出兩種以上蛋白質之間的相互依賴性以及這些蛋白質相互作用所起到的重要生理功能［2］。對于蛋白質相互作用研究的方法不斷涌現(xiàn)，有蛋白芯片技術，X-射線晶體學技術、酵母雙雜交、帶標簽-pull down技術、免疫共沉淀技術、多肽陣列技術以及熒光顯微鏡技術［3］。首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心蛋白質組學研究測試室已經開展將pull-down或免疫共沉淀之后的樣品再經液質聯(lián)用來鑒定相互作用的蛋白，本文介紹一種通過谷胱甘肽-s-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)-pull down技術尋找大鼠腎組織中與誘餌蛋白相互作用的蛋白，再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對pull down樣品進行分離，最后通過液質聯(lián)用技術來鑒定與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1)實驗樣品:帶GST標簽的誘餌蛋白，ZS蛋白(由于研究成果權限的原因，特此命名)，其表達載體由首都醫(yī)科大學賀俊崎教授實驗室構建提供;大鼠［購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001］腎組織也是該實驗室提供。

2)試劑:過硫酸銨，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，TEMED，二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，碘乙酰胺，SDS，甘氨酸，Tris，CHAPS均為美國 GE公司產品;胰蛋白酶(測序級)為美國Promega公司產品;乙腈，甲酸，考馬斯亮藍G250為美國Sigma公司產品。

1.2 大鼠腎組織GST-pull down實驗

實驗方法參考文章［4-5］，取新鮮大鼠腎組織稱質量后剪成碎塊，用預冷的裂解緩沖液(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，1%Triton X-100，Benzamidine 1 mmol/L)以10 mL溶液:1 g組織的比例對大鼠腎組織進行蛋白質裂解，期間用勻漿器勻漿10 min(15 W)，再冰浴超聲，條件設置為超聲5 s，間歇5 s，共12個循環(huán)，最后4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清即為大鼠腎組織裂解液。

將等量純化好的GST和ZS蛋白瓊脂糖珠分別加入大鼠腎組織裂解液中，在4℃上下顛倒持續(xù)混合3 h，4℃，3 000 r/min離心1 min收集沉淀，并用1 mL預冷的洗滌液Ⅰ(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.1%Tween 20，3%BSA，Benzamidine 1 mmol/L)洗滌沉淀，共洗滌4次，每次振蕩洗滌完用4℃，3 000 r/min離心1 min，收集沉淀，再用1 mL預冷的洗滌液Ⅱ(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.1%Tween 20，Benzamidine 1 mmol/L)洗滌沉淀1次，最后4℃，3 000 r/min離心1 min，收集沉淀，將此GST-pull down沉淀復合物中加入適量的一維電泳蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5 min使蛋白變性，離心后取上清進行SDS-PAGE，采用7 cm凝膠，濃度為10%，再用考馬斯亮藍染色電泳后凝膠。

1.3 膠內酶切

根據(jù)PAGE凝膠的染色結果，從 ZS蛋白 pull down大鼠腎組織后的樣品泳道上切下與對照差異有統(tǒng)計學意義的條帶，將切下的條帶再切碎成小顆粒，經脫色，還原，烷基化，之后30℃水浴酶切18 h［6-7］。

1.4 液質聯(lián)用鑒定與ZS蛋白相互作用蛋白

將酶切完成的樣品經超聲振蕩后，15 000 r/min離心15 min，取5 μL上清進行納升級液相與ESI源離子阱質譜聯(lián)用分析(Bruker Daltonics德國)。儀器由HyStarTM3.2和EsquireControlTM5.2軟件(Bruker Daltonics)控制。液相條件:EasyTMC18(2 cm×100 μm，5 μm)為富集柱;EasyTMC18(10 cm ×75 μm，3 μm)為分析柱;流速設300 nL/min;流動相A是含0.1%甲酸的水溶液;流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。梯度設置為0 min B液5%，0～45 min B液上升到35%，45～47 min，B液上升到95%，49 min B液95%，共運行50 min。質譜條件:離子化方式是納升電噴霧正離子模式;每次掃描中5個強度最高的離子進行串聯(lián)質譜分析;毛細管電壓設4 000 V;Skimmer電壓設40V;霧化裝置壓力0.069 MPa;干燥氣5 L/min，溫度設220℃;采集范圍:MS為20～1 500 M/Z，MS/MS為100～2 500 M/Z。數(shù)據(jù)分析軟件:Data Analysis 4.0;數(shù)據(jù)經軟件分析之后通過Mascot檢索軟件檢索本地SwissPort(201005)中的大鼠數(shù)據(jù)庫，檢索條件設為，Trypsin酶切，固定修飾選擇M氧化，可變修飾為碘乙酰胺烷基化，漏切位點為1，MS質量數(shù)誤差0.4%，MS/MS的質量數(shù)誤差為0.7，所用儀器選ESI-Trap。依據(jù)MASCOT算法，匹配肽段數(shù)在3條以上，并且得分(score值)在可信區(qū)間內的蛋白為成功鑒定到的蛋白。

2 實驗結果

2.1 ZS蛋白pull-down大鼠腎組織結果

從圖1中可看出ZS蛋白pull-down大鼠腎組織裂解液的樣品泳道(圖中標注為3)比GST pull-down樣品泳道(圖中標注為2)在相對分子質量55 000與72 000之間明顯多出一個條帶，標注為#，再對應大鼠腎組織裂解液(lysate)泳道(圖中標注為1)和右側的ZS蛋白泳道(圖中標注為4)顯示，在ZS蛋白泳道相應位置并未出現(xiàn)此條帶，在Lysate泳道此處有條帶，這說明該條帶是大鼠腎組織裂解液中由ZS蛋白pulldown下來的成分。

2.2 液質聯(lián)用鑒定結果

圖1 GST pull-down實驗尋找大鼠腎組織裂解液中與ZS蛋白相互作用的蛋白，所得沉淀經SDS-PAGE電泳后結果Fig.1 Screening of ZS binding partners by GST pull-down assay.The precipitates were run on SDS-PAGE

將此特異性條帶(標記為#)切下之后進行膠內酶切，用酶解原液直接上樣，經納升級液相分離之后由ESI源離子阱質譜檢測。圖2是樣品的基峰離子流圖(base peak chromatogram，BPC)，由每個時間點質譜圖中最強離子的強度連續(xù)描繪所得。由BPC可看出，從12 min開始出峰，到45 min B相即有機相從5%升至35%樣品基本洗脫完全，液相梯度設置合適，對樣品的分離效果很好。液相每時每刻分離的樣品進到質譜里進行檢測，每個時刻將檢測到的強度最高的5個離子作為母離子進行碎裂，做二級質譜(MS/MS)，所得一級、二級質譜峰進過軟件分析再通過數(shù)據(jù)庫檢索，由MASCOT算法得出Score值超過39分的為可信鑒定結果。本研究共鑒定出32種蛋白(表1)。圖3顯示二氫嘧啶酶(dihydropyrimidinase)的質譜鑒定情況。該蛋白是鑒定結果中得分最高的蛋白質，有127條序列與數(shù)據(jù)庫高度匹配，其中一條得分最高的序列K.IPNGVNGVEDR.M，是質荷比(M/Z)為585.3的母離子經過離子阱的碰撞誘導裂解(collision-induced dissociation，CID)之后鑒定所得。在17.1 min時，該多肽從液相中大量洗脫出來，經質譜分析得到一級質譜峰如圖3(A)，該母離子為二價形式即(M+2H)2+，經二級碎裂后所得質譜峰如圖3(B)。

3 討論

Pull-down技術是由Smith及其研究團隊于1988年利用GST融合標簽純化出GST融合蛋白，由此該技術開始成為一種熱門研究方法［1，8］。該技術特異性較強、操作簡便，是一種很好的篩選蛋白質相互作用的方法，但是并不能避免假陽性，還需要做進一步的研究來確證蛋白相互作用。

表1 #蛋白條帶經液相色譜質譜聯(lián)用鑒定結果Tab.1 The protein band#identified by liquid chromatography-electrospary ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

圖2 #條帶膠內酶切之后經液相色譜/質譜聯(lián)用分析所得基峰離子流圖Fig.2 Base peak chromatogram of the protein band#after digested in gel by liquid chromatography-electrospary ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

圖3 #條帶膠內酶切后經液質聯(lián)用分析所得質譜圖Fig.3 MS spectra of band#after digested in gel by liquid chromatography-clectrospary inoization mass spectrometry dandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

在蛋白質組學研究中通常使用與納升級液相聯(lián)用的電噴霧電離源離子阱質譜來分析樣品［9］，其液相部分能自動進樣，并用C18反向柱對樣品進行濃縮分離，由此可實現(xiàn)高通量和高靈敏度。電噴霧源串聯(lián)質譜法測定多肽氨基酸序列的關鍵步驟是通過CID過程得到適當碎片離子。采用的方法是在多肽一級質譜的基礎上選擇母離子，通常是(M+H)+或(M+nH)n+離子，在適當?shù)呐鲎材芰肯屡c惰性氣體發(fā)生碰撞，導致多肽碎裂產生碎片離子。CID過程產生的碎片離子一般分為兩大組6個系列，從N端開始的碎片離子以an、bn、cn表示，從C端開始的碎片離子以xn、yn、zn表示，母離子的某一系列碎片離子(比如yn系列)內相鄰兩個離子的質量數(shù)之差即是斷裂處氨基酸殘基的質量，由此可推斷出多肽的氨基酸序列，不同系列離子所推斷的氨基酸序列可互補［10-11］。本實驗中離子阱檢測到的二級碎裂峰中大多是y離子，這與母離子碎裂方式及離子阱的檢測特點有關。

通過已知蛋白質相互作用網(wǎng)絡顯示了蛋白質的相互依存關系，有很多蛋白質不僅僅是兩兩結合的，大多數(shù)情況是多個蛋白質形成大的復合體并相互作用來行使某種生理功能，而我們可能只已知某幾個蛋白的功能，但是通過對蛋白質相互作用的研究可發(fā)現(xiàn)其他蛋白質并了解其功能，由此更豐富并完善蛋白質相互作用網(wǎng)絡［12］。傳統(tǒng)研究蛋白相互作用的方法在未知蛋白質的鑒定上有困難［13-14］，而引用質譜技術正好可彌補這一缺憾，并能實現(xiàn)高通量。

本實驗通過pull-down技術結合液質聯(lián)用鑒定了大鼠腎組織中可能與ZS蛋白相互作用的32種蛋白，此方法的建立為進一步研究ZS蛋白的功能奠定了基礎。從表1所示的質譜鑒定結果來看，大多數(shù)屬代謝相關酶類以及細胞骨架蛋白。其中Ezrin、moesin與ZS蛋白所在家族中其他蛋白有相互作用，而ZS蛋白會與其家族成員形成大的復合體并與細胞骨架蛋白有相互作用［15-16］。由此可說明本實驗結果是可靠的。由于pull-down實驗并不能保證所拉下來的蛋白一定與誘餌蛋白是特異結合的，所以鑒定到的蛋白是否與ZS蛋白確有特異結合并相互作用仍需進一步實驗來證實。

［1］涂占晗，林旭.蛋白質相互作用研究的常用方法進展及比較［J］. 中國當代醫(yī)藥，2012，19(14):18-20.

［2］Bertolazzi P，Bock M E，Guerra C.On the functional and structuralcharacterization of hubs in protein-protein interaction networks［J］. BiotechnolAdv，2012，12(Online).

［3］Dwane S，Kiely P A.Tools used to study how protein complex are assembled in signaling cascades［J］.Bioeng Bugs，2011，2(5):247-259.

［4］Zhang J，Cheng S，Xiong Y，et al.A novel association of mGluR1a with the PDZ scaffold protein CAL modulates receptor activity［J］.FEBS Lett，2008，582(30):4117-4124.

［5］Yang L，Wang Y，Chen P，et al.Na(+)/H(+)exchanger regulatory factor 1(NHERF1)is required for the estradiol-dependent increase ofphosphatase and tensin homolog(PTEN)protein expression［J］.Endocrinology，2011，152(12):4537-4549.

［6］Fulda S，Huang F，Nilsson F， et al.Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803. Identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations［J］.Eur J Biochem，2000，267(19):5900-5907.

［7］Smith M P，Zougman A，Ho J T，et al.A systematic analysis of the effects of increasing degrees of serum immunodepletion in terms of depth of coverage and other key aspects in top-down and bottom-up proteomic analyses［J］.Proteomics，2011，11(11):2222-2235.

［8］Smith D B，Johnson K S.Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase［J］.Gene，1988，67(1):131-140.

［9］Batycka M，Inglis N F，Cook K，et al.Ultra-fast tandem massspectrometry scanning combined with monolithic column liquid chromatography increases through put in proteomic analysis［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(14):2074-2080.

［10］Ahmed K E，Chen W Q，John J P，et al.Complete sequencing of the recombinant granulocyte-colony stimulating factor(filgrastim)and detection of biotinylation by mass spectrometry［J］.Amino Acids，2010，38(4):1043-1049.

［11］陳主初，肖志強.疾病蛋白質組學［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006:100-103.

［12］Peter Schuck.Protein interactions biophysical approaches for the study of complex reversible systems［M/OL］.New York:Springer，2007［2013-02-21］.http://link.springer.com/book/10.1007/978-0-387-359663-3/page/1.

［13］殷愛紅，胡家，阮昌，等.微波輔助的蛋白質酶解方法［J］. 首都醫(yī)科大學學報，2012，33(4):134-136。

［14］徐小燕，夏蒲，邢亞楠，等.凍結破碎法提取組織蛋白方法初探［J］.中國醫(yī)科大學學報，2010，39(5):336 339.

［15］Sugiura T，Shimizu T，Kijima A，et al.PDZ adaptors:their regulation of epithelial transporters and involvement in human diseases［J］.J Pharm Sci，2011，100(9):3620-3635.

［16］Lee J H，Nam J H，Park J，et al.Regulation of SLC26A3 activity by NHERF4 PDZ-mediated interaction［J］.Cell Signal，2012，24(9):1821-1830.