白 宇 陳 彥 國(guó)添柱 劉慶陽(yáng) 楊 雪 馮 穎 閆卓紅 王麗佳 張權(quán)庚

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069)

DNA甲基化異常在腫瘤中非常普遍，包括全基因組的低甲基化和一些腫瘤抑制基因的驅(qū)動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。全基因組的低甲基化被認(rèn)為是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的主要原因，從而導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞中基因的一步步突變［1-2］，而腫瘤抑制基因驅(qū)動(dòng)子區(qū)域的高甲基化直接導(dǎo)致這些基因的低表達(dá)或不表達(dá)［2-3］。腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是一種最常見(jiàn)惡性度最高的腦腫瘤，此病患者平均生存時(shí)間只有約14.5個(gè)月，與其他惡性腫瘤類似，DNA甲基化異常在這類腫瘤中非常普遍［1，4-5］。盡管腫瘤基因組甲基化異常已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并被廣泛研究近30年，但導(dǎo)致這種異常的原因一直不明。新近有研究［6-7］顯示DNMT3A在約20%的急性髓細(xì)胞白血癥(acute myelocytic leukemia，AML)患者中發(fā)生突變而導(dǎo)致其活性喪失，但DNMT3A在GBM中的突變尚未有報(bào)道，并且即使AML中20%左右的DNMT3A突變也不能解釋腫瘤中的廣泛基因組低甲基化。推測(cè)仍然有其他原因與基因組的廣泛低甲基化有關(guān)［8-9］。

DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的催化作用下完成的。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶主要包括 DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。本研究主要探索DNMT3B是否在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中有突變。

1 材料與方法

1.1 材料與標(biāo)本

1)材料:RPMI1640培養(yǎng)基和PBS均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Trizol購(gòu)于美國(guó) Invitrogen 公司;DEPC，DL2000、DNA Marker、MarkerⅣ、隨機(jī)引物均購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、primer star GLX均購(gòu)自日本Takara生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。在中國(guó)美吉測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)使用DNASTAR7.1軟件。GBM細(xì)胞系LN229購(gòu)于ATCC，并由本實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)。

2)組織標(biāo)本:25例GBM標(biāo)本均來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，腫瘤分級(jí)按照2007世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)劃分均為最高級(jí)Ⅳ級(jí)［10］。所有病例在外科手術(shù)前均未進(jìn)行放射治療、化學(xué)藥物治療。所有患者均經(jīng)影像學(xué)、臨床化驗(yàn)指標(biāo)及病理學(xué)診斷確診并建立完整的隨訪資料。標(biāo)本在獲得后立即投入液氮中，一部分用于提取RNA，其余部分標(biāo)本于－80℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI的 Genbank序列(序列號(hào):NM-006892)對(duì)DNMT3B全長(zhǎng)的擴(kuò)增進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。DNMT3B上游引物:5'-CCTTCAAAGTGCCATGAGTTGTCTC-3'。下游引物:5'-TTCATACTCAGTTTGCAGCAATAGC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2.5 kb。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GBM細(xì)胞系LN229，復(fù)蘇于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的T75瓶中。于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。換液，傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定后使用。

1.2.3 總RNA提取

應(yīng)用Trizol試劑從培養(yǎng)的LN229細(xì)胞中提取總RNA。每使用1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃ 10 000 g離心15 min，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min。4℃ 10 000 g離心10 min，移去上清，75%乙醇洗滌RNA沉淀，每使用1 mL Trizol至少加1 mL 75%乙醇。4℃ 5 000 g離心5 min，棄上清，室溫放置干燥RNA沉淀，所獲 RNA用于 RT-PCR檢測(cè)或－80℃保存。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(reverse transcription，RT)使用 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，隨機(jī)引物擴(kuò)增第一條鏈cDNA。所得cDNA進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系均為25 μL，5 × PS 緩沖液 5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.5 μL，primer star GLX 0.25 μL，DNA 模版 2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積至25 μL。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3 min;98 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 2.5 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。切膠測(cè)序。

1.2.5 DNA測(cè)序與分析

所有25個(gè)標(biāo)本擴(kuò)增的全長(zhǎng)DNMT3B送美吉測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果使用DNASTAR7.1軟件進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中擴(kuò)增全長(zhǎng)DNMT3B

為摸索擴(kuò)增全長(zhǎng)DNMT3B cDNA的條件，首先培養(yǎng)LN229細(xì)胞，從中提取提取總RNA并用PCR方法擴(kuò)增DNMT3B。成功擴(kuò)增出全長(zhǎng)DNMT3B約2.5 kb(圖1)。測(cè)序驗(yàn)證該P(yáng)CR產(chǎn)物包含完整DNMT3B的讀碼框架。

圖1 從GBM細(xì)胞系LN229中擴(kuò)增DNMT3B全長(zhǎng)Fig.1 Full-length cDNA of DNMT3B amplified from GBM cell line LN229

2.2 在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中擴(kuò)增全長(zhǎng)DNMT3B

隨后對(duì)25例GBM組織的總RNA進(jìn)行RT-PCR，成功擴(kuò)增出全長(zhǎng)DNMT3B基因，擴(kuò)增產(chǎn)物為約2.5 kb的片段(圖2)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后送測(cè)序，對(duì)所得測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2.3 腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中DNMT3B基因型測(cè)序結(jié)果

將擴(kuò)增出的25例GBM織的DNMT3B全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比與NCBI中發(fā)表的DNMT3B讀碼框架進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示所有標(biāo)本中的cDNA均沒(méi)有氨基酸序列的點(diǎn)突變，但只有一例標(biāo)本表達(dá)正常的DNMT3B轉(zhuǎn)錄本(樣本號(hào):1073)，其余均檢測(cè)到不同的DNMT3B的剪切變異體，其中2例標(biāo)本(樣本號(hào):624，1074)只擴(kuò)增出缺失外顯子 10，21，22的DNMT3B-V3變異體(圖3)，3例標(biāo)本(樣本號(hào):491，1103，1116)為主要表達(dá)缺失外顯子 5，10，21，22 的DNMT3B-V7變異體(圖4)，其余比對(duì)結(jié)果為亂碼，推測(cè)為多種變異體的混合物。

3 討論

圖2 25例GBM患者標(biāo)本中擴(kuò)增的DNMT3BFig.2 Results of RT－PCR to amplify DNMT3B from 25 GBM patient samples GBM:glioblastoma.

圖3 GBM樣本624和1074僅僅表達(dá)DNMT3B-V3剪切變異體Fig.3 GBM sample 624 and 1074 only expressed DNMT3B－V3

圖4 GBM樣本491，1103和1116僅僅表達(dá)DNMT3B－V7剪切變異體Fig.4 GBM sample 491，1103 and 1116 only expressed DNMT3B－V7

腫瘤基因組低甲基化自從1983年在結(jié)腸癌組織中被發(fā)現(xiàn)至今已有30年［11-12］。這種異常作為腫瘤表觀遺傳學(xué)異常的主體已幾乎各種人類中被發(fā)現(xiàn)并被廣泛進(jìn)行了研究。這種異常在GBM中也非常普遍［4-5］，但導(dǎo)致這種異常的原因一直不明。研究腫瘤基因組低甲基化發(fā)生的原因不僅對(duì)理解腫瘤發(fā)生的機(jī)制具有重要意義，并且對(duì)腫瘤這種嚴(yán)重威脅人類生命和健康的防治具有重要意義。該研究以我們已建立的GBM標(biāo)本庫(kù)對(duì)DNMT3B的突變進(jìn)行了探索以期找出導(dǎo)致這種最常見(jiàn)的腦腫瘤基因組低甲基化的原因［13-15］。

DNA甲基化是由DNA甲基化酶在胞嘧啶5位碳原子上轉(zhuǎn)移上甲基的過(guò)程，使DNA甲基化是指DNA分子上CpG雙核苷中的胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)，正常組織基因組70%CpG島被甲基化，是基因組的一種根本修飾。甲基化有兩種情況，一種是在DNA復(fù)制情況下，母鏈已經(jīng)甲基化，新合成鏈發(fā)生的甲基化(又被稱為Maintenance甲基化)由DNMT1負(fù)責(zé)，另一種是對(duì)兩條鏈都沒(méi)有甲基化的模板進(jìn)行甲基化，如沒(méi)有分化的干細(xì)胞，由 DNMT3A 和 DNMT3B 負(fù)責(zé)［8，16-17］。盡管DNMT3A被發(fā)現(xiàn)在約20%的AML腫瘤發(fā)生多位點(diǎn)的突變［6-7］，但在本課題組所檢查的約30例GBM中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些突變，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DNMT1的突變。在本研究中，也檢查了DNMT3B的點(diǎn)突變，在所有被研究的23例GBM中，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)改變氨基酸序列的點(diǎn)突變。這個(gè)結(jié)果顯示DNMTs的點(diǎn)突變不是導(dǎo)致GBM基因組低甲基化的原因。

盡管沒(méi)有DNMTs的點(diǎn)突變，但所研究的23例GBM標(biāo)本中，只有一例以表達(dá)全長(zhǎng)DNMT3B為主，2例表達(dá)缺失外顯子10、21、22的DNMT3B的V3剪切變異體，3例表達(dá)缺失外顯子5、10、21、22的 V7變異體，其余比對(duì)結(jié)果為亂碼，推測(cè)為存在多種變異體的混合物。目前NCBI中已知的DNMT3B轉(zhuǎn)錄變異體一共有6種，除無(wú)外顯子缺失的DNMT3B-V1外，其他剪切變異體均有外顯子缺失，分別為 DNMT3B-V2(缺失外顯子exon10)、DNMT3B-V3(缺失外顯子exon10，exon21，exon22)、DNMT3B-V6(exon10，exon21)、DNMT3B-V7(缺失 外 顯子 exon5，exon10，exon21，exon22)、DNMT3B-V8(exon4，exon5，exon10，exon21，exon22)。盡管 DNMT3B-V1和 DNMT3B-V3是被發(fā)現(xiàn)的最多的變異體，但是只有DNMT3B-V1，DNMT3B-V2被證明具有酶活性，而其他變體則由于缺失C 端催化區(qū)域而不具備酶活性［18-19］。Ostler等［20］在多種癌細(xì)胞系中一共發(fā)現(xiàn)了約20多種DNMT3B轉(zhuǎn)錄本，絕大多數(shù)缺失C末端缺失催化區(qū)，將DNMT3B-V7轉(zhuǎn)入293細(xì)胞改變其基因表達(dá)譜，其中一些基因的表達(dá)異常與DNA甲基化有關(guān)。在腎臟HEK293細(xì)胞中DNMT3B-V7轉(zhuǎn)錄本顯著改變DNA甲基化模式，但由于不尚不清楚哪個(gè)催化區(qū)是甲基化改變的原因，可能是縮短的DNMT3B-V7蛋白通過(guò)結(jié)合DNMT3B相關(guān)部分影響甲基化進(jìn)程，或者是縮短的DNMT3B蛋白通過(guò)直接與DNA結(jié)合影響 DNMT酶的催化活性［21］。由于絕大多數(shù)GBM中以表達(dá)各種各樣的DNMT3B變異體為主，筆者推測(cè)GBM中廣泛的基因組低甲基化可能由于這些變異體引起。本課題組正擴(kuò)大樣本數(shù)在GBM中研究這些DNMT3B變異體存在的圖譜，并研究這些變異體的存在基因組低甲基化狀態(tài)的相關(guān)性，希望進(jìn)一步確定GBM以及其他腫瘤基因組低甲基化的根本原因。

［1］Eden A，Gaudet F，Waghmare A，et al.Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation［J］.Science，2003，300(5618):455.

［2］Feinberg A P，Ohlsson R，Henikoff S.The epigenetic progenitor origin of human cancer［J］.Nat Rev Genet，2006，7(1):21-33.

［3］Jones P A，Baylin S B.The fundamental role of epigenetic events in cancer［J］.Nat Rev Genet，2002，3(6):415-428.

［4］Noushmehr H，Weisenberger D J，Diefes K，et al.Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma［J］.Cancer Cell，2010，17(5):510-522.

［5］Cadieux B，Ching T T，VandenBerg S R，et al.Genomewide hypomethylation in human glioblastomas associated with specific copy number alteration，methylenetetrahydrofolate reductase allele status，and increased proliferation［J］.Cancer Res，2006，66(17):8469-8476.

［6］Le Gallo M，O'Hara A J，Rudd M L，et al.Exome sequencing of serous endometrial tumors identifies recurrent somatic mutations in chromatin-remodeling and ubiquitin ligase complex genes［J］.Nat Genet，2012，44(12):1310-1315.

［7］Ley T J，Ding L，Walter M J，et al.DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，2010，363(25):2424-2433.

［8］Kwon Y J，Lee S J，Koh J S，et al.Genome-wide analysis of DNA methylation and the gene expression change in lungcancer［J］.J Thorac Oncol，2012，7(1):20-33.

［9］Foltz G，Yoon J G，Lee H，et al.DNA methyltransferasemediated transcriptional silencing in malignant glioma:a combined whole-genome microarray and promoter array analysis［J］.Oncogene，2009，28(29):2667-2677.

［10］ Louis D N，Ohgaki H，Wiestler O D，et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system［J］.Acta Neuropathol，2007，114(2):97-109.

［11］ Feinberg A P，Vogelstein B.Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts［J］.Nature，1983，301(5895):89-92.

［12］ Wu X，Rauch T A，Zhong X，et al.CpG island hypermethylation in human astrocytomas［J］.Cancer Res，2010，70(7):2718-2727.

［13］ Laffaire J，Everhard S，Idbaih A，et al.Methylation profiling identifies 2 groups of gliomas according to their tumorigenesis［J］.Neuro Oncol，2011，13(1):84-98.

［14］ Pennisi E.History of science.The case of the midwife toad:fraud or epigenetics［J］.Science，2009，325(5945):1194-1195.

［15］Etcheverry A，Aubry M，de Tayrac M，et al.DNA methylation in glioblastoma:impact on gene expression and clinical outcome［J］.BMC Genomics，2010，11:701.

［16］ Liu K，Wang Y F，Cantemir C，et al.Endogenous assays of DNA methyltransferases:Evidence for differential activities of DNMT1，DNMT2，and DNMT3 in mammalian cells in vivo［J］.Mol Cell Biol，2003，23(8):2709-2719.

［17］Hermann A，Gowher H，Jeltsch A.Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61(19 －20):2571-2587.

［18］ Robertson K D，Uzvolgyi E，Liang G，et al.The human DNA methyltransferases(DNMTs)1，3a and 3b:coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors［J］.Nucleic Acids Res，1999，27(11):2291-2298.

［19］Okano M，Xie S，Li E.Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA(cytosine-5)methyltransferases［J］.Nat Genet，1998，19(3):219-220.

［20］ Ostler K R，Davis E M，Payne S L，et al.Cancer cells express aberrant DNMT3B transcripts encoding truncated proteins［J］.Oncogene，2007，26(38):5553-5563.

［21］ Suetake I，Shinozaki F，Miyagawa J，et al.DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction［J］.J Biol Chem，2004，279(26):27816-27823.