安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 張寬朝 阮飛 李成 文漢＊

黑豆為豆科植物的種子，含有豐富的蛋白質(zhì)、卵磷脂、脂肪、維生素、黑色素及煙酸等，具有醫(yī)食同療的重要生理功能（王敏等，2008）。過氧化物酶（POD）是一類廣泛存在于各種植物、動物和微生物體內(nèi)的氧化還原酶，能夠催化過氧化氫和有機(jī)過氧化物對各種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用，參與細(xì)胞代謝的氧化還原過程（羅龍海等，2008；田國忠和李懷芳，2001）。本試驗(yàn)對黑豆中的過氧化物酶進(jìn)行酶學(xué)特性的研究，以期為進(jìn)一步研究過氧化物酶的基本特性、調(diào)控黑豆的加工過程、拓展過氧化物酶的獲取渠道提供理論參考和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 黑豆：廬州黑豆，市售，粉碎機(jī)破碎，備用；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、EDTA、Tris、氫氧化鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán) G-250等均為國產(chǎn)分析純；SP-722E分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、MC99-3自動液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 POD酶活性測定及活性單位 采用愈創(chuàng)木酚法測量酶活力。此方法主要是利用有過氧化氫存在條件下，POD能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470 nm處有最大光吸收，測量吸光度值并計(jì)算酶活力。

POD活性測定參考文獻(xiàn)的方法，略有不同（Amako等，1994）。測定系統(tǒng)為4 mL，包括l mL 40 mmol/L 愈創(chuàng)木酚，l mL 40 mmol/L H202，1.9 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.O），30℃水浴預(yù)熱。加入0.1 mL酶液于30℃反應(yīng)5 min，波長470 nm下測定OD值。

POD活力單位定義為 ：每分鐘OD值變化0.001為一個酶的活力單位（U）。

1.2.2 酶學(xué)特性研究

1.2.2.1 粗酶液的提取 準(zhǔn)確稱取豆殼粉末4 g，放入研缽，放少許石英砂，加入0.2 mol/L pH值為6.0的磷酸緩沖液160 mL進(jìn)行研磨，室溫下抽提24 h后，將粗提液經(jīng)脫脂紗布過濾，再經(jīng)10000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2.2 酶的最適pH 按1.2.1酶活測定體系，分別加入 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、40 mmol/L 愈創(chuàng)木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30℃水浴預(yù)熱，加入酶液，于30℃恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性，繪圖確定酶的最適pH。

1.2.2.3 酶的最適溫度 按1.2.1酶活測定體系，分別加入40 mmol/L愈創(chuàng)木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30 ℃水浴預(yù)熱，加入酶液，分別于 25、30、35、40、45、50 ℃準(zhǔn)確恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性，繪圖確定酶的最適溫度。

1.2.2.4 愈創(chuàng)木酚濃度對酶反應(yīng)的影響及其表觀Km 在最適溫度下，分別加入5、10、20、40 mmol/L愈創(chuàng)木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30 ℃水浴預(yù)熱，加入酶液，準(zhǔn)確恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性，按Lineweave Burk法采用雙倒數(shù)法作圖。

1.2.2.5 過氧化氫濃度對酶反應(yīng)的影響及其表觀Km 在最適溫度下，分別加入40 mmol/L愈創(chuàng)木酚，0.5、1、5、10、20、40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30℃水浴預(yù)熱，加入酶液，準(zhǔn)確恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性，按Lineweave Burk法采用雙倒數(shù)法作圖。

1.2.2.6 金屬離子對POD活性的影響 按1.2.1酶活測定體系， 分別加入 0.5、1.0、1.5、3.0 mg/mL含 MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3、NaCl、KCl 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，40 mmol/L愈創(chuàng)木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30 ℃水浴預(yù)熱，加入酶液，恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.2.7 常見化合物對POD活性的影響 按1.2.1酶活測定體系分別加入0.5、1.0、1.5 mg/mL含抗壞血酸（維生素C）、檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.2 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，40 mmol/L愈創(chuàng)木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30℃水浴預(yù)熱，加入酶液，恒溫反應(yīng)5 min，迅速取出測定酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD最適pH 由圖1可見，隨著緩沖液pH逐漸增大，黑豆POD的活性呈先升高后降低的趨勢，pH為5.0時酶活最高，因此POD的最適pH為5.0，，在酸性范圍內(nèi)。這與蓮藕、枇杷果肉、小麥種子POD的最適pH相同，與甘蔗苗、豆殼和草莓果實(shí)、荔枝果皮POD最適pH相近（龐學(xué)群和段學(xué)武，2004）。

2.2 POD最適溫度與溫度耐受性 從圖2可見，溫度為20～30℃時，酶活性隨著溫度的升高而逐漸上升，究其原因可能是，適度提高溫度，有利于酶朝著有利于底物發(fā)生作用的催化構(gòu)象轉(zhuǎn)變。當(dāng)溫度為30℃時，黑豆POD的酶活性最高。隨著溫度的進(jìn)一步升高，會破壞酶的活性構(gòu)象，酶活性呈不斷下降的趨勢。因此，黑豆POD的最適反應(yīng)溫度是30℃，比蓮藕、荔枝果皮和枇杷果肉、豆殼、小麥種子略低，但與草莓果實(shí)一致 （王志兵等，2010；羅龍海等，2008；闕瑞琦等，2007；龐學(xué)群和段學(xué)武，2004）。

2.3 黑豆POD Km 由圖3可見，Km即為直線在X負(fù)軸上截距的負(fù)倒數(shù)。根據(jù)計(jì)算可得：黑豆過氧化物酶對愈創(chuàng)木酚和過氧化氫的表觀Km值分別為0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，說明，黑豆的POD與愈創(chuàng)木酚和過氧化氫的親和力較大。

2.4 金屬離子對POD活性的影響 以磷酸鹽緩沖液內(nèi)含金屬離子作為反應(yīng)體系，測定不同金屬離子對黑豆POD活性的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可見，在供試濃度范圍內(nèi)，外源Cu2+的加入，均能夠激活 POD 酶活性， 而 Mg2+、Al3+、K+、Na+對酶活性均有一定程度的抑制作用。

2.5 化合物對POD活性的影響 以磷酸鹽緩沖液內(nèi)含抗壞血酸（維生素C）、檸檬酸、EDTA、EDTANa24種常見POD化合物作為反應(yīng)體系，測定不同化合物對黑豆POD活性的影響，結(jié)果見圖5。從5圖可見，在供試濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸、檸檬酸、EDTA、EDTA-Na2均對黑豆POD活性具抑制作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)針對黑豆中對豆乳粉、豆奶營養(yǎng)價值和感官質(zhì)量影響均較大的過氧化物酶進(jìn)行了酶學(xué)特性的研究，以期為黑豆產(chǎn)品的深加工和綜合利用與開發(fā)提供理論參考。結(jié)果表明，POD最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度30℃，對愈創(chuàng)木酚和過氧化氫的表觀Km值分別為0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，在供試濃度范圍內(nèi)，Cu2+可激活POD酶活性，Mg2+、Al3+、K+、Na+對酶活性有抑制作用，而維生素C、檸檬酸、EDTA、EDTA-Na2均是黑豆POD的抑制劑。

[1]王敏，李丹，李榮和，等.黑豆?fàn)I養(yǎng)價值及功能特性應(yīng)用的研究與進(jìn)展[J].長春大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，18（2）：104 ～ 107.

[2]田國忠，李懷芳.植物過氧化物酶研究進(jìn)展[J].武漢植物學(xué)研究，2001，19（4）：332 ～ 344.

[3]羅龍海，范三紅，張美祥，等.小麥種子過氧化物酶的純化及其部分酶學(xué)性質(zhì)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16（1）：181 ～ 182.

[4]龐學(xué)群，段學(xué)武.荔枝果皮過氧化物酶的純化及部分酶學(xué)性質(zhì)研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2004，12（5）：449 ～ 454.

[5]王志兵，趙楊，邱志舉，等.豆殼過氧化物酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].長春工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，31（5）：506 ～ 510.

[6]闕瑞琦，張麗麗，郭小路，等.蓮藕過氧化物酶的分離純化及性質(zhì)研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，29（12）：63 ～ 67.

[7]Amako K，Chen G X，Asada K.Separate assay specific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants[J].Plant Cell Physiol，1994，35：497 ～ 504.