陳 倩，叢玉艷，劉興偉，宋先忱

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽110866； 2.遼寧省畜牧科學(xué)院，遼寧 遼陽 110000)

在山羊生產(chǎn)中，采用冷凍精液輸精普遍導(dǎo)致母羊受胎率低，極大降低了山羊的繁殖力，解凍溫度和時間通過影響解凍后精液品質(zhì)而影響受胎率。卜書海等[1]建議在實(shí)踐中采用75 ℃解凍奶牛細(xì)管凍精2～6 s，Olesenz[2]直接把0.25 mL綿羊細(xì)管凍精放于70 ℃水浴中解凍8 s，目前，遼寧絨山羊細(xì)管凍精的解凍溫度以38～40 ℃為主。本試驗(yàn)旨在研究不同解凍方法對絨山羊細(xì)管凍精解凍后精子品質(zhì)的影響，以期明確絨山羊細(xì)管凍精的適宜解凍方法，從而為提高其解凍后的精子活力和受胎率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 選擇2周歲的遼寧絨山羊種公羊6只，用假陰道法采集精液，經(jīng)檢查精子活力達(dá)標(biāo)(均高于65%)后混精(精子活力為75%)，然后制成0.25 mL細(xì)管凍精，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)分別采用37 ℃ 12 s、39 ℃ 8 s和70 ℃ 4 s 3種方法對細(xì)管凍精進(jìn)行解凍，通過對精子活力、精子存活時間、頂體完整率和畸形率，以及解凍后精清(該部分實(shí)質(zhì)是精清+稀釋液，簡稱“精清”)酶進(jìn)行分析，并結(jié)合升溫曲線，以研究解凍方法對絨山羊細(xì)管凍精精子品質(zhì)的影響。

1.3指標(biāo)測定 精子活力：在37 ℃下，借助400倍顯微鏡，觀察視野中直線前進(jìn)運(yùn)動精子占總精子數(shù)的百分比。

精子存活時間：在37 ℃水浴中保存解凍精液，從第3小時開始，每隔1 h進(jìn)行一次活力檢測，直到精子全部死亡為止。具體方法是由第1次檢查時間到倒數(shù)第2次檢查之間的間隔時間，加上最后1次與倒數(shù)第2次間隔時間的一半，其總時間即為精子存活時間。

頂體完整率：將精液樣品制作抹片，經(jīng)干燥、固定、水洗、姬姆薩染色并風(fēng)干后，置于1 000倍生物顯微鏡下觀察。精子頂體完整率=頂體完整型精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。精子畸形率：將精液樣品制作抹片，經(jīng)干燥、固定、水洗、美藍(lán)染色、水洗并風(fēng)干后，置于顯微鏡下檢查。精子畸形率=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

精清部分酶活性：將解凍后的精液在4 ℃、2 000 r·min-1條件下離心10 min，收集精清部分，分別利用谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、山羊透明質(zhì)酸酶(HYD)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，測定其中GOT活性、LDH活性和HYD含量。

升溫曲線：采用溫度控制儀檢測凍精解凍過程中的溫度變化情況。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1解凍方法對解凍后精子品質(zhì)的影響 解凍方法對解凍后精子活力的影響顯著(P<0.05)。70 ℃下解凍4 s的精子活力顯著高于37 ℃ 12 s的(P<0.05)，與39 ℃下解凍8 s的差異不顯著但有增高趨勢(P>0.05)(表1)。解凍方法對解凍后精子存活時間的影響不顯著(P>0.05)，但對精子頂體完整率的影響顯著(P<0.05)，70 ℃下解凍4 s的精子頂體完整率顯著高于其余兩解凍方法，37 ℃ 12 s較39 ℃ 8 s解凍的精子頂體完整率顯著增高(P<0.05)。解凍方法對精子畸形率的影響顯著(P<0.05)，70 ℃下解凍4 s的精子畸形率顯著低于其余兩解凍方法，37 ℃下解凍12 s的精子畸形率顯著低于39 ℃ 8 s(P<0.05)。

2.2解凍方法對解凍后精清酶的影響 解凍方法對凍精解凍后的精清GOT活性、LDH活性和HYD含量均有顯著影響(P<0.05)，其中70 ℃ 4 s解凍后的精清GOT活性顯著低于37 ℃ 12 s和39 ℃ 8 s(P<0.05)，后兩種解凍方法間差異不顯著(P>0.05)；而70 ℃ 4 s 的精清LDH活性和HYD含量均顯著低于37 ℃ 12 s(P<0.05)，且與39 ℃ 8 s差異不顯著但有降低的趨勢(P>0.05)(表2)。

2.3各解凍方法解凍時的升溫曲線 37 ℃解凍12 s時精液的溫度為29.4 ℃，經(jīng)過危險溫區(qū)(-25～-5 ℃)所用的平均時間為1.69 s，在此溫區(qū)內(nèi)升溫速率為11.85 ℃·s-1；39 ℃ 8 s冷凍精液溫度為17 ℃，經(jīng)過危險溫區(qū)所用的平均時間為1.60 s，在此溫區(qū)內(nèi)升溫速率為12.48 ℃·s-1；70 ℃ 4 s冷凍精液溫度為6.6 ℃，經(jīng)過危險溫區(qū)所用的平均時間為0.74 s，在此溫區(qū)內(nèi)升溫速率為27.06 ℃·s-1(圖1)。可見，70 ℃ 4 s的解凍方法冷凍精液解凍后溫度最低，其次是39 ℃ 8 s，最高是37 ℃ 12 s；經(jīng)過危險溫區(qū)速率最快的是70 ℃ 4 s，其次是39 ℃ 8 s，最慢的是37 ℃ 12 s。

3 討論

3.1解凍方法對絨山羊細(xì)管凍精精子品質(zhì)的影響 精子的活動能力與精子的受精力和受胎率有著密切關(guān)系[3]，精子活力和頂體形態(tài)可作為判斷受胎率的指標(biāo)[4]。Saacke和White[5]報道，頂體完整率與90 d不返情率的相關(guān)系數(shù)為0.81。Januskauskas等[6]也發(fā)現(xiàn)，牛冷凍精液解凍后的精子活力與穿卵精子數(shù)及56 d不返情率呈極顯著正相關(guān)。因此，觀察精子的活力、存活時間、頂體完整率和畸形率，對評價凍精解凍方法的優(yōu)劣具有重要意義。

表1 各解凍方法解凍后精子品質(zhì)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Sperm quality of thawed semen with different thawing method

表2 解凍方法對解凍后精清酶的影響Table 2 Enzyme in seminal plasma of thawed semen with different thawing method

圖1 各解凍方法解凍時冷凍精液的升溫曲線Fig.1 The temperature-rising curve of frozen semen thawed with different method

近年來，綿羊細(xì)管冷凍精液的解凍溫度和時間變化很大。Paulenz等[7]對綿羊細(xì)管凍精用不同解凍方法(70 °C 8 s、50 °C 9 s或 35 °C 12 s)解凍后配種發(fā)現(xiàn)，35 °C解凍的產(chǎn)羔率最高。此外，Maxwell等[8]主張將細(xì)管凍精在37 ℃水浴中解凍60 s，Graham和Mocé[9]提出的解凍方法是39 ℃解凍30 s，常永梅[10]發(fā)現(xiàn)最佳解凍方法為40～44 ℃解凍8 s，而Olesenz[2]建議在70 ℃水浴中解凍8 s，世界范圍內(nèi)大都傾向于采用35～40 ℃解凍。目前遼寧絨山羊的細(xì)管凍精的解凍方法以38～40 ℃為主，馮霞等[11]通過對精子活力的比較發(fā)現(xiàn)，遼寧絨山羊細(xì)管凍精的最佳解凍溫度為38 ℃，解凍時間為60 s，精子活力平均為40.3%。

世界范圍內(nèi)解凍溫度不一致可能主要由于羊品種的特異性及精子膜對冷凍解凍溫度驟變的敏感性不同造成，膜受損傷的程度及精子的畸形率也不同，從而精子細(xì)胞表現(xiàn)出不同的活力[12]。解凍時要求精子細(xì)胞盡快越過危險溫區(qū)(-25～-5 ℃)，避免低溫對精子的損傷[13]。在本研究中，在70 ℃下解凍，精子經(jīng)過危險溫區(qū)速率最快，對精子細(xì)胞損傷小，精子活力和頂體完整率顯著高于在37 ℃ 12 s和39 ℃ 4 s的解凍效果，70 ℃ 4 s的解凍方法對保持精子的正常形態(tài)較為有利。然而Pontbriand等[14]發(fā)現(xiàn)，35～40 ℃或50～70 ℃解凍對綿羊精子存活率或頂體完整性和產(chǎn)羔率無影響，而淵錫藩等[15]認(rèn)為，解凍溫度太高或太低都不理想。這些不同研究結(jié)果的產(chǎn)生可能與品種間的差異有關(guān)。

3.2解凍方法對絨山羊細(xì)管凍精解凍后精清酶的影響 酶是精清、精子的重要組成成分，對維持精子的正常代謝發(fā)揮著重要作用。精子在解凍過程中冰晶的消失會對精子造成機(jī)械性損傷，當(dāng)精子線粒體受到損害時，相關(guān)酶類就向精清中逸出，因而精子中的酶活性下降、精清中的酶活性上升，從而導(dǎo)致精子受精能力下降。因此，精清中的酶活性可作為衡量精液質(zhì)量的生化指標(biāo)，能判斷精子在解凍過程中的受損程度。

精子中GOT與精子低溫?fù)p傷的程度有關(guān)，GOT的釋放量與解凍精子活力存在顯著負(fù)相關(guān)[16]。精清中酶活性變化及其與精子頂體損傷間有密切關(guān)系。西門塔爾牛凍精解凍后精清中GOT活性與精子活力和頂體完整率顯著負(fù)相關(guān)[17]。LDH與精子運(yùn)動及存活的供能過程有密切關(guān)系。LDH活性可以作為衡量豬精液品質(zhì)的一個指標(biāo)，并且能夠反映經(jīng)稀釋液處理體外保存后精子的活力情況[18]。精液中HYD含量與精子活力、頂體完整率呈負(fù)相關(guān)，因此可以把測定精清中HYD活性作為預(yù)測受胎率高低的指標(biāo)。Foulkes和Watson[19]以精清中HYD的活性評定牛精子的完整性。Crabo和Graham[20]測定豬冷凍精液中的GOT活性和精子中的HYD活性及精子頂體完整率，以作為實(shí)驗(yàn)室評定精液品質(zhì)的方法。本研究發(fā)現(xiàn)，70 ℃ 4 s解凍方法可有效降低絨山羊細(xì)管凍精解凍后精清的GOT活性、LDH活性和HYD含量，這表明該解凍方法可降低解凍對精子的損傷，從而有利于保持精子的正常形態(tài)和活力，有望提高配種受胎率。

4 結(jié)論

70 ℃ 4 s的解凍方法能使絨山羊細(xì)管凍精在解凍過程中快速通過危險溫區(qū)，有效緩解解凍對精子的損傷，對保持精子的正常形態(tài)和活力較為有利。

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