趙麗麗，王普昶，陳 超，馬 林

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州 貴陽(yáng)550025；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng)550025）

百脈根（Lotuscorniculatus）是豆科百脈根屬多年生草本植物，別名瘠地苜蓿、五葉草。其株型低矮、匍匐，耐熱性強(qiáng)，夏季一般牧草生長(zhǎng)不良時(shí)，百脈根仍能良好生長(zhǎng)，是水土保持和果園生草的理想草種［1－2］。具有營(yíng)養(yǎng)豐富、莖葉柔軟細(xì)嫩多汁、適口性好、皂素含量低、家畜飼用安全等特性，可用于刈割青飼、調(diào)制干草、加工草粉和混合飼料等，被認(rèn)為是中國(guó)溫帶亞熱帶地區(qū)極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)良牧草［3－5］。中國(guó)很多地區(qū)曾從國(guó)外引種栽培，雖在各地生長(zhǎng)良好，但都未在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，優(yōu)良品種缺乏是其主要限制因子之一。我國(guó)野生百脈根種質(zhì)資源豐富，廣泛分布于河北、云南、貴州、四川和甘肅等地［1］。但目前針對(duì)野生百脈根種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、篩選研究較少，因此，加大對(duì)野生百脈根種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、篩選可以有效地推進(jìn)百脈根新品種的培育工作。

高溫是植物生長(zhǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的逆境因子之一，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)及其產(chǎn)量和品質(zhì)［6］，其對(duì)植物的危害規(guī)律也一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。植物耐熱性受植物對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性及環(huán)境條件的復(fù)雜性等多因子影響，屬于多基因控制的數(shù)量性狀［7］，利用個(gè)別或少數(shù)指標(biāo)的簡(jiǎn)單比較難以真實(shí)地反映植物耐熱性的遺傳本質(zhì)［8－10］。主成分分析能夠在較少損失原有信息的前提下，把多個(gè)彼此相關(guān)的指標(biāo)簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)［11］。隸屬函數(shù)法是根據(jù)模糊數(shù)學(xué)原理，利用多個(gè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值的累加值，綜合評(píng)估植物的耐熱性。將主成分分析與隸屬函數(shù)法相結(jié)合，并綜合考慮各綜合指標(biāo)的權(quán)重，經(jīng)加權(quán)求和評(píng)價(jià)植物的耐熱性，既能充分利用各指標(biāo)間的深層次聯(lián)系，彌補(bǔ)和緩解單個(gè)指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)直接評(píng)定的片面性和重復(fù)性，又能兼顧各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)度，使評(píng)價(jià)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果更為接近。該方法在評(píng)價(jià)植物的耐熱性方面，得到了很多學(xué)者的認(rèn)可［7－11］。百脈根種質(zhì)的適應(yīng)性研究主要集中在抗旱性鑒定方面［12］，耐熱性研究少見(jiàn)報(bào)道。為探索百脈根耐熱機(jī)制及耐熱指標(biāo)，評(píng)價(jià)各種質(zhì)的耐熱性，本研究以正常溫度與高溫脅迫條件下8個(gè)百脈根種質(zhì)為研究對(duì)象，測(cè)定其在高溫脅迫下的6個(gè)生理生化指標(biāo)，應(yīng)用主成分分析、隸屬函數(shù)法，經(jīng)加權(quán)求和綜合評(píng)價(jià)8個(gè)百脈根種質(zhì)的耐熱性，初步篩選出耐熱性強(qiáng)的百脈根種質(zhì)，以期為發(fā)掘優(yōu)良基因、遺傳改良及新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 8份供試百脈根種質(zhì)材料分別是B01、B02、B03、B04、B05、B08、B12和 B18。B01、B02、B03和B04為中國(guó)農(nóng)科院草原研究所中期庫(kù)收集入庫(kù)的野生種質(zhì)材料，分別來(lái)源于日本、加拿大、內(nèi)蒙古和貴陽(yáng)；B05為市售百脈根品種，南方型；B08、B12和B18分別采自貴州省的施秉、威寧和納雍。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高溫脅迫處理方法 2011年4月將百脈根種子播種于由河沙、蛭石和腐殖質(zhì)土按1∶1∶1混合的花盆中，置于室外進(jìn)行日常養(yǎng)護(hù)，兩個(gè)月后置于溫室中進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，分別設(shè)置22℃（對(duì)照）、35℃和45℃處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。溫室內(nèi)空氣相對(duì)濕度80%。在各盆底放置托盤(pán)，托盤(pán)中放置一定量的水分（水深1.0～1.5cm）補(bǔ)充基質(zhì)水分。脅迫處理6d后，隨機(jī)采集植株中部葉片，測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定方法 參照李合生［13］和鄒琦［14］的方法，葉片相對(duì)電導(dǎo)率用雷磁DDSJ－308A型電導(dǎo)儀測(cè)定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測(cè)定；游離脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性分別采用NBT光化還原法、愈創(chuàng)木酚氧化法和紫外分光光度法測(cè)定［15］。以上測(cè)定均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 17.0軟件和Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA，P＜0.05），主成分分析［16］和隸屬函數(shù)計(jì)算。

1.3.1 隸屬函數(shù)分析 試驗(yàn)材料各主成分的隸屬函數(shù)值按公式（1）［11］求得。

式中，U（xi）為各種質(zhì)第i個(gè)主成分的隸屬函數(shù)值，xi為各種質(zhì)某一主成分得分值，ximax和ximin分別為所有參試種質(zhì)中第i個(gè)主成分的最大值和最小值。

1.3.2 權(quán)重 根據(jù)主成分的貢獻(xiàn)率的大小按公式（2）［9］計(jì)算各主成分的權(quán)重。

式中，Wi表示第i個(gè)主成分在所有主成分中的重要程度；pi為各種質(zhì)第i個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率。

1.3.3 綜合評(píng)價(jià)值 高溫脅迫下各試驗(yàn)種質(zhì)耐熱性用主成分評(píng)價(jià)所得的耐熱性綜合評(píng)分值D值表示，按公式（3）［9］計(jì)算可得。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)百脈根生理生化指標(biāo)的影響 在22℃下，8份百脈根種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率、MDA、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性間均無(wú)顯著差異，隨處理溫度的增加，各指標(biāo)發(fā)生了變化，種質(zhì)間出現(xiàn)差異（圖1）。

隨處理溫度的增加，各百脈根種質(zhì)的葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量明顯上升。在35和45℃，種質(zhì)B04、B08的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量分別最小，在45℃下，B02的相對(duì)電導(dǎo)率最大。在35℃高溫處理下，種質(zhì)B02和B18的MDA含量最大，但升到45℃時(shí)，B03的MDA含量迅速增加，成為MDA含量最大的種質(zhì)材料。

在高溫脅迫下，各百脈根種質(zhì)Pro含量均有增大趨勢(shì)，且隨著脅迫溫度的上升而明顯增加。在45℃處理下，各種質(zhì)Pro含量均為22℃的7倍以上。此時(shí)，種質(zhì)B08和B05的Pro含量顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05）；種質(zhì)B03和B18的Pro含量較小，與其他種質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。

隨處理溫度的增加，各百脈根種質(zhì)SOD酶活性均呈先升高后降低趨勢(shì)。在35℃下，種質(zhì)B08和B05的SOD活性顯著高于除B04之外的其他種質(zhì)，B03的活性顯著低于除B02之外的其他種質(zhì)（P＜0.05）。當(dāng)處理溫度升高到45℃時(shí)，種質(zhì)B08的SOD酶活性仍最大，B04次之，B02和B03的SOD酶活性較小，且與其他種質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。

隨處理溫度的增加，各種質(zhì)的CAT酶活性和POD酶活性（除B01種質(zhì)外）均呈逐漸升高趨勢(shì)。在兩個(gè)高溫處理下，種質(zhì)B08的POD酶活性最高，B04和B05的CAT酶活性最高。

2.2 高溫脅迫下百脈根各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 高溫脅迫下，百脈根種質(zhì)各生理生化指標(biāo)間均存在不同程度的相關(guān)性（表1）。其中相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量，CAT活性與Pro含量和POD活性均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。Pro含量與相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、POD活性，CAT活性與 MDA含量間均呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。

圖1 高溫脅迫對(duì)百脈根生理生化指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of high temperature stresses on physiological and biochemical index of Lotus corniculatus

表1 高溫脅迫下百脈根各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of physiological biochemical indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

2.3 生理生化指標(biāo)的主成分分析 經(jīng)過(guò)主成分分析將6個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成6個(gè)主成分，其中前兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為57.20%和28.21%，累積貢獻(xiàn)率為85.41%（表2）。按累積貢獻(xiàn)率≥85%確定主成分個(gè)數(shù)［11］，選擇前兩個(gè)主成分作為評(píng)價(jià)百脈根耐熱性的綜合指標(biāo)。表2列出了各主成分的特征向量值，以X（1）和X（2）分別代表第1和第2主成分，X1～X6分別表示6個(gè)單項(xiàng)生理指標(biāo)，以各指標(biāo)的特征向量為系數(shù)，可得到兩個(gè)綜合指標(biāo)與原6項(xiàng)單項(xiàng)指標(biāo)的線性組合方程。

主成分特征向量越大，各單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)度越大［10］。百脈根種質(zhì)耐熱性評(píng)價(jià)第1主成分中CAT活性和MDA含量的特征向量較大，其次是Pro含量和相對(duì)電導(dǎo)率；第2主成分中SOD活性的特征向量最大，其次為POD活性。植物受到高溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害，膜透性增強(qiáng)，相對(duì)電導(dǎo)率增加；細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加。CAT活性和Pro含量的增加均有利于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定。因此，第1主成分主要反映高溫脅迫條件下維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子；SOD和POD是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶，因此，第2主成分主要反映高溫脅迫條件下生物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)。

2.4 耐熱性的綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)主成分表達(dá)式及隸屬函數(shù)公式分別求得百脈根種質(zhì)的各綜合指標(biāo)值X（i）及其隸屬函數(shù)值U（x）和綜合耐熱D值（表3），根據(jù)各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率，利用公式（2）可分別求出各綜合指標(biāo)的權(quán)重。經(jīng)計(jì)算，兩個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.669 7和0.330 3。

耐熱性綜合評(píng)價(jià)值（D）值越大表明耐熱性越強(qiáng)，反之則越弱。綜合3個(gè)溫度梯度下8個(gè)百脈根種質(zhì)資源的 D值，其大小分別為B01（0.567 6）、B02（0.664 3）、B03（1.129 0）、B04（1.589 1）、B05（1.520 8）、B08（1.757 2）、B12（1.108 8）和 B18（1.416 9）。

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫已成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要逆境因素［17］。大量研究表明，高溫脅迫下，植物為了抵御高溫，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化，細(xì)胞膜透性、MDA含量、Pro含量、SOD酶活性、POD酶活性和CAT酶活性都會(huì)發(fā)生變化。不同種、甚至不同品種間上述指標(biāo)的變化情況因植物對(duì)高溫耐受性的不同而不同，因此，常被用于植物耐熱性評(píng)價(jià)指標(biāo)［18－20］。本研究中，各百脈根種質(zhì)隨高溫脅迫強(qiáng)度的增加，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量上升，Pro含量增加，CAT和POD酶活性（除B01種質(zhì)外）均呈升高趨勢(shì)，SOD酶活性呈先升高后降低趨勢(shì)，表明高溫脅迫下，百脈根細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，導(dǎo)致生物膜破壞，膜透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，相對(duì)電導(dǎo)率值增大；MDA是膜脂過(guò)氧化最終分解產(chǎn)物，葉片中的MDA含量增加表明細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)。游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在高溫脅迫下，各百脈根種質(zhì)Pro含量增加，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)滲透壓、降低植物細(xì)胞酸度、穩(wěn)定細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)的作用。SOD、CAT和POD是植物對(duì)膜脂過(guò)氧化作用的酶促防御體系中的保護(hù)酶。其中SOD是植株內(nèi)活性氧清除的第一道防線，酶系統(tǒng)主要是在SOD酶的作用下將·O2－岐化成H2O2和O2，而CAT和POD酶則進(jìn)一步將H2O2催化生成H2O，從而減少·O2－和H2O2的積累。

表2 高溫脅迫下百脈根各指標(biāo)的主成分分析Table 2 Principal component analysis of different indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

表3 高溫脅迫下百脈根的綜合指標(biāo)值X（i）及其權(quán)重、隸屬函數(shù)值U（x）、綜合評(píng)價(jià)值D及排序Table 3 The values of comprehensive index X（i）and weight，subordinate function value U（x），comprehensive evaluation value D and prediction value of Lotus corniculatus under high temperature stress

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下百脈根各指標(biāo)間存在不同程度的相關(guān)性，使各指標(biāo)所提供的信息發(fā)生了重疊。如果直接利用這些指標(biāo)評(píng)價(jià)百脈根種質(zhì)的耐熱性強(qiáng)弱，難以得到準(zhǔn)確的結(jié)果，需要應(yīng)用主成分分析與隸屬函數(shù)相結(jié)合，進(jìn)行各百脈根種質(zhì)的耐熱性綜合評(píng)價(jià)值，這樣既考慮各單項(xiàng)指標(biāo)間的相互關(guān)系，又兼顧各指標(biāo)的重要性，也避免了人為確定權(quán)重的主觀性。采用主成分分析法將原來(lái)6個(gè)彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成兩個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，累積貢獻(xiàn)率達(dá)85.411%。其中第1主成分特征向量較大的是CAT活性和MDA含量，其次是Pro含量和相對(duì)電導(dǎo)率；第2主成分特征向量最大的是SOD活性，其次為POD活性。因此第1主成分主要反映了高溫脅迫條件下維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子，第2主成分主要反映了高溫脅迫條件下生物體保護(hù)酶系統(tǒng)。

依據(jù)貢獻(xiàn)率大小和累積貢獻(xiàn)率，確定兩個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.669 7和0.330 3。利用綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和權(quán)重，計(jì)算出各百脈根種質(zhì)的耐熱性綜合評(píng)價(jià)值。綜合推測(cè)，各種質(zhì)耐熱性順序?yàn)锽08＞B04＞B05＞B18＞B03＞B12＞B02＞B01。百脈根種質(zhì)B04、B08、B12和B18為貴州本土種質(zhì)資源，其中B08和B04表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐熱性，強(qiáng)于市售的南方型品種B05，說(shuō)明當(dāng)?shù)乇就涟倜}根種質(zhì)具有優(yōu)良的耐熱性狀，結(jié)合正確的育種手段，對(duì)其加以培育和選擇，有望培育出適應(yīng)性更強(qiáng)、穩(wěn)產(chǎn)性更好的新品種。

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