劉婷婷，曾 馳，楊團元，宋 瑤，劉超帝，繆禮鴻*

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

中國傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程是利用曲及環(huán)境中多種微生物的固態(tài)混合發(fā)酵結果，其中酵母菌在酒醅的發(fā)酵過程中起主導作用[1]。白酒發(fā)酵過程的酵母菌種類及功能具有多樣性，如從清香型白酒固態(tài)釀造過程中分離出多株不同種類的酵母菌[2]。各酵母菌株除酒精產生能力有差異外，與酒的風味物質的產生有密切關系[3-6]。本研究在對前期白云邊酒釀造過程中的主要細菌及霉菌分析的基礎上[7]，對白云邊酒釀造過程中的優(yōu)勢酵母菌進行了分離鑒定和發(fā)酵特征的比較研究，為進一步揭示白云邊酒風味物質產生的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

實驗菌株：東方伊薩酵母屬（Issatchenkia orientalis）CBS5147由以色列技術研究院惠贈；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）XG-1為本實驗室分離和保存；安琪耐高溫釀酒活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）TRADY（以下簡稱TRADY）：購自安琪酵母公司。

1.1.2 實驗材料

白云邊酒堆積料、酒醅和發(fā)酵用高粱原料均由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母菌種子培養(yǎng)基：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母粉10g，水1000mL；配制固體培養(yǎng)基時添加1.5%（w/v）瓊脂粉。

酵母菌分離培養(yǎng)基：馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基[8]；曲汁培養(yǎng)基：取新鮮酒醅20g，加水200mL，煮沸30min，過濾，補水至200mL，加入2%蔗糖和1.5%瓊脂粉，115℃滅菌30min。

酵母菌酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：配制淀粉含量為18.00%的高粱淀粉漿，60℃糊化30min，按15U/g淀粉的比例加入液化酶，95℃液化90min，冷卻后調pH值至4.5，然后按150U/g淀粉的比例加入糖化酶，65℃糖化30min，制成發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑

Taq DNA聚合酶和dNTP：購自上海申能博彩公司；DL2000 marker：購自大連寶生物公司；PCR引物NS1、NS4、16S-27F、16S-1492R委托北京奧科生物技術公司合成。

1.2 儀器與設備

ZHJHlll2B潔凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；DNP9028型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；BIOMETRA PCR儀：德國BIOMETRA公司；UNICO 7200型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌株分離方法

采用稀釋平板分離法[8]。分別取白云邊酒醅及發(fā)酵堆積料用無菌水浸出，按不同梯度稀釋。取不同稀釋度的樣液各0.1mL分別涂布于不同的分離培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2d～3d，挑去平板上數(shù)量占優(yōu)勢和形態(tài)有一定差異的酵母菌落，經進一步劃線分離純化后，對菌株進行編號、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母菌總菌數(shù)的測定方法

采用血球板計數(shù)法[8]。

1.3.3 酵母菌對糖的利用

在氮源基礎培養(yǎng)基[8]中分別添加不同的糖為唯一碳源，115℃滅菌30min后，接種各菌株37℃培養(yǎng)1d～2d，觀察各菌株的生長情況。

1.3.4 DNA的提取

接種酵母菌單菌落于YPD液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后，用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌基因組DNA，檢測后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 提取DNA的PCR擴增和分子測序

以提取的不同菌株的基因組DNA為模板作PCR分別擴增26S rDNA D1/D2區(qū)域，擴增引物為通用引物NS1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3' 和NS4P：5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'，以及通用引物16S-27F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和16S-1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR 擴增體系（25μL）：引物NS1/NS4（10μmol/L）各1μL，10×PCR 緩沖液（含20mmol/L的Mg2+）2.5μL，模板DNA（約50ng/mL）1.8/2.8μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，雙蒸水18/17μL。

PCR反應程序：94℃預變性5min，94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，共進行30個循環(huán)后，72℃延伸10min。PCR產物經檢測為單一條帶后送往北京奧科純化測序。

1.3.6 微生物系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

用校正后的分離菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索，比較分離菌株與已報道的酵母菌株相應序列的相似程度。根據(jù)搜索結果，用ClustalX1.8軟件進行多序列匹配排列，通過Neighbor-Joining分析方法構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.7 酵母菌耐高溫能力測定

劃線接種待測試的酵母菌于YPD平板上，分別置于33℃和42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察酵母菌生長情況。

1.3.8 酵母菌耐酒精能力測定

按2%接種量分別接種預先培養(yǎng)好的酵母菌液于酒精度分別為0、8%vol、10%vol、12%vol和14%vol的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h，用分光光度計在波長630nm處測定酵母菌在不同酒精濃度條件下生長達到的細胞濃度（OD值）。

1.3.9 酵母菌的液態(tài)酒精發(fā)酵方法

將各酵母菌分別接種于YPD種子液培養(yǎng)基中，經120r/min搖床培養(yǎng)12h后，按2%接種量分別接種于酒精發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃靜置發(fā)酵72h后，取發(fā)酵醪液測定酵母菌總數(shù)、殘還原糖及最終pH值，并對各菌株的發(fā)酵醪液進行蒸餾取蒸餾液采用氣相色譜測定各餾出液的酒精度和乙酸乙酯等其他成分。殘還原糖的測定采用3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[8]。

1.3.10 氣相色譜檢測發(fā)酵醪餾出液的色譜條件

氣相色譜條件：Agilent Technologies 7890A；色譜柱（50m×0.25mm×0.25μm）；內標物：乙酸正戊酯、叔戊醇、2-乙基丁酸；載體：氮氣；色譜檢測條件：初始溫度為35℃，保持4min；以3℃/min的速率上升至70℃；再以10℃/min的速率上升至200℃，保持15min，總運行時間為43.67min。入口溫度為230℃，出口溫度為240℃。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定結果

2.1.1 酵母菌對糖的利用及其形態(tài)觀察結果

從白云邊酒堆積發(fā)酵料和酒醅中共分離獲得7株酵母菌。其中4株酵母菌（編號分別為Z1、Z2、Z3、和Z4）是從3個堆積發(fā)酵樣品中分離獲得的，為37℃培養(yǎng)條件下分離平板上數(shù)量占優(yōu)勢的酵母菌；另外3株酵母菌（編號分別為BYB-2、BYB-3和FJ5）是分別從3個出池酒醅中分離獲得的，其在分離平板上的菌落數(shù)占相對優(yōu)勢，并且菌落形態(tài)有一定差異。

7株酵母菌對不同糖類的利用情況結果表明，這7株酵母菌均能利用果糖和蔗糖；均不能利用菊糖、纖維二糖、綿子糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和L-山梨糖。其中菌株Z4、BYB-2、BYB-3和FJ5能利用D-半乳糖；Z4和BYB-2菌株還能利用D-海藻糖；Z2和Z4菌株能利用D-木糖。除菌株BYB-2的菌落表面濕潤外，其他6株酵母菌落表面均較干燥。

2.1.2 酵母菌的分子分類鑒定結果

選取上述分離的7株酵母菌和與其相近的典型菌株（只取已正式定種的酵母菌的標準菌株）的26S rDNA序列進行相似性比較后，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。其中Z1、Z2、Z3和FJ5菌株與已報道的東方伊薩酵母菌（I.orientalis）的同源性為99%，可歸為該種；Z4、BYB-2和BYB-3分別與熱帶假絲酵母（C.tropicalis）、釀酒酵母（S.cerevisiae）和畢赤酵母（P.galeiformis）的同源性均為99%，可以分別歸為相對應的種。

圖1 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列采用鄰接法構酵母菌相關菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining tree constructed showing the phylogenetic relationships among the isolated yeast strains and other related strains based on 26S rDNA D1/D2 region sequence

2.2 酵母菌酒精發(fā)酵結果

采用高粱為原料，各酵母菌株酒精發(fā)酵結果見表1。

表1 酵母菌酒精發(fā)酵結果Table 1 Alcoholic fermentation results of different yeast strains

由表1可知，菌株BYB-2的發(fā)酵酒精度最高，達到10.0%vol，與菌株TRADY酒精發(fā)酵能力相近，與其他非釀酒酵母菌株相比，這2株釀酒酵母成熟發(fā)酵醪的殘還原糖含量也最低。菌株BYB-3的發(fā)酵酒精度最低，僅為3.8%vol，4株東方伊薩酵母菌株（Z1、Z2、Z4和FJ5）發(fā)酵的酒精度為5%vol左右。表明從白云邊酒醅中分離的7株酵母菌產酒精能力最強的為釀酒酵母，其他非釀酒酵母仍有一定的產酒精能力。

2.3 酵母菌耐高溫能力和耐酒精能力結果

2.3.1 各酵母菌的耐高溫能力測定結果

不同溫度條件下的培養(yǎng)結果表明，7株酵母菌在33℃條件下生長均很好；42℃條件下東方伊薩酵母菌Z1、Z2、Z3和FJ5，熱帶假絲酵母Z4和畢赤酵母BYB-3的生長幾乎不受影響，長勢優(yōu)于東方伊薩酵母標準菌株CBS5147，但釀酒酵母TRADY和BYB-2菌株生長受到明顯抑制。

表2 酵母菌耐高溫能力Table 2 Growth of different yeast strains at 33℃and 42℃

2.3.2 酵母菌耐酒精能力測定結果

5株酵母菌株（Z1、Z4、FJ5、BYB-2和BYB-3）的耐酒精能力測定結果見圖2。東方伊薩酵母菌Z1的耐酒精能力最強，在含不同酒精濃度的培養(yǎng)基中（0%除外）的細胞濃度最大。其次為東方伊薩酵母FJ5和釀酒酵母BYB-2，畢赤酵母BYB-3的耐酒精能力最差。

圖2 酵母菌耐酒精能力曲線Fig.2 Alcohol tolerance of different yeast strains

2.4 酵母菌株酒精發(fā)酵產物分析

酵母菌酒精發(fā)酵產物的氣相色譜分析結果見表3。3株釀酒酵母發(fā)酵醪的酒精度最高，其余5株非釀酒酵母菌發(fā)酵醪的酒精度以熱帶假絲酵母Z4最高，為（6.5±0.3）%vol，其次是東方伊薩酵母菌Z1，為（5.2±0.1）%vol。乙酸乙酯產量最高的菌株分別為從白云邊酒醅和堆積料中分離的2株東方伊薩酵母Z1和FJ5，平均含量達204.19mg/L，比所測試的3株釀酒酵母乙酸乙酯平均含量8.43mg/L高23倍，也明顯高于其標準菌株CBS5147（116.66 mg/L），另外2株東方伊薩酵母Z2和Z3產乙酸乙酯的能力與Z1菌株相近。其他2株非釀酒酵母C.tropicalisZ4 和P.galeiformisBYB-3酒精發(fā)酵產物中乙酸乙酯的含量比釀酒酵母更低，由此可以推斷，東方伊薩酵母是白云邊酒中乙酸乙酯的主要產生菌。

分析結果表明，3株S.cerevisiae菌株的異戊醇和正丙醇平均含量分別為264.91mg/L和22.81mg/L，比3株I.orientalis平均含量（117.89mg/L和10.49mg/L）均高1倍以上。Z1菌株酒精發(fā)酵產物中丁酸含量只有16.1mg/L，比CBS5147（424.57mg/L）和FJ5（749.23mg/L）菌株丁酸含量低很多，而菌株Z2和Z3的酒精發(fā)酵產物中丁酸含量分別為56.80mg/L和249.56mg/L（Z2、Z3菌株其他成分的分析結果與Z1相似，數(shù)據(jù)未列出），結果表明，不同的I.orientalis菌株產丁酸的能力差異較大。Pichia.sp.BYB-3菌株的丁酸含量更高，達到1253.65mg/L，比3株S.cerevisiae平均含量高約24倍。對不同酵母菌株酒精發(fā)酵產物分析結果表明，同種酵母菌不同菌株的酒精發(fā)酵某些風味成分含量具有很高的相似性和穩(wěn)定性，可作為酵母菌株分類鑒定的重要參考依據(jù)。

表3 各酵母菌株酒精發(fā)酵樣品氣相色譜分析結果Table 3 Gas chromatography results of alcohol fermentation by different yeast strains

3 討論

本研究從白云邊酒高溫堆積料中僅分離到耐熱的東方伊薩酵母和熱帶假絲酵母，可以推斷東方伊薩酵母是白云邊酒高溫堆積過程中的優(yōu)勢酵母菌，這一結果與白云邊酒采用高溫制曲和高溫堆積發(fā)酵生產工藝相一致。有研究報道表明，汾酒中占優(yōu)勢的酵母菌為伊薩酵母屬（Issatchenkia）[9]。耐高溫的東方伊薩酵母出現(xiàn)在不同品牌的中國白酒釀造過程中并占優(yōu)勢，可能與中國傳統(tǒng)白酒具有某些相似的發(fā)酵工藝有關。從白云邊酒成熟的酒醅中除分離獲得I.orientalis外，還分離到S.cerevisiae，C.tropicalis等多個屬的酵母菌株，表明有多種酵母菌參入了白云邊酒的釀造過程。

東方伊薩酵母是一種能夠在高溫條件下生長并連續(xù)發(fā)酵產生乙醇的非釀酒酵母菌[10]，其耐受性好，是一種潛在的木質纖維素酒精發(fā)酵菌種[11]。除在中國白酒中的存在外，其廣泛存在于葡萄表面及葡萄酒酒釀造體系中[12-13]。這些研究大多集中在對微生物的多樣性的研究，但對東方伊薩酵母在中國白酒發(fā)酵過程的生理功能知之甚少。

本研究報道了從中國傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中分離到I.orentalis菌株、并確定該菌株是堆積發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株。酵母菌純種酒精發(fā)酵試驗結果顯示，I.orentalis具有一定的酒精發(fā)酵能力，其產乙酸乙酯能力比釀酒酵母高20倍以上，而產異戊醇和正丙醇能力比釀酒酵母低2～3倍。有研究表明，白酒中的乙酸乙酯主要產生于酒醅的堆積發(fā)酵過程[14-15]，因此，可以推斷I.orentalis可能是白云邊酒中乙酸乙酯的主要產生菌。而以前白酒中產乙酸乙酯等風味物質的研究報道多為Hanseniaspora和Pichia屬的酵母菌。這一研究結果也為中國傳統(tǒng)白酒風味物質的產生給出了一種可能的解釋，即中國傳統(tǒng)白酒酯含量高、高級醇含量低的主要原因是由于其獨特的發(fā)酵工藝，使I.orentalis等耐熱好、產酯率高的非釀酒酵母在發(fā)酵過程中占主導所致。

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