劉宇巖，楊博逸，李永芳，盧響響，王 達(dá)，孫貴范

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)即自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上，其病因極其復(fù)雜，常見的有胚胎染色體異常，子宮畸形或?qū)m腔粘連等解剖異常，黃體功能不足或甲狀腺功能低下等內(nèi)分泌異常，支原體、衣原體、弓形蟲、巨細(xì)胞病毒等感染因素，以及抗磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體陽性等自身免疫功能紊亂等[1]。然而臨床上排除了以上因素后，仍有近1/2的患者病因不明，故稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。已有研究發(fā)現(xiàn)，RSA的發(fā)生率在整個(gè)孕齡婦女群體中占1%～2%，而其中約有50%為URSA[2]。造成URSA的主要病因之一即為母體內(nèi)編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的基因677位點(diǎn)發(fā)生突變(677C→T)。該基因位點(diǎn)的突變可直接導(dǎo)致MTHFR的酶活性下降，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體內(nèi)同型半胱氨酸水平的升高[3-4]。已有研究證實(shí)同型半胱氨酸水平升高可破壞機(jī)體凝血與纖溶之間的平衡，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)。由其所致的胎盤動脈栓塞可進(jìn)一步引發(fā)胚胎供血不足、絨毛壞死等不良結(jié)果，而這些都是導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的重要原因[5]。截至目前，國內(nèi)外已進(jìn)行了大量關(guān)于MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)的研究，但其所得到的研究結(jié)果之間卻存在很大差異。因此，本研究主要通過對1997—2011年發(fā)表共22篇文獻(xiàn)(9篇關(guān)于中國人群的研究，13篇關(guān)于除中國外其他12個(gè)國家的研究)進(jìn)行分析，進(jìn)而對母體MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行一次宏觀評價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所納入的文獻(xiàn)必須為針對MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA的患者和健康人群進(jìn)行的病例對照研究。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)研究中所包含的URSA患者與健康個(gè)體均來自統(tǒng)一總體，年齡、民族、生活習(xí)慣等基本資料均嚴(yán)格匹配，均衡可比；(2)入選文獻(xiàn)中必須明確URSA的定義(如注明流產(chǎn)次數(shù)和發(fā)生的時(shí)間)，WHO于2009年明確了RSA的次數(shù)，即兩次或兩次以上的流產(chǎn)[6]，因此本Meta分析所納入的URSA人群應(yīng)為在排除其他臨床上可查的致流產(chǎn)因素后連續(xù)自然流產(chǎn)兩次或兩次以上的流產(chǎn)個(gè)體；(3)入選文獻(xiàn)中還需分別列出病例組和對照組中各基因型(即CC、CT、TT)個(gè)體的數(shù)量，或者可通過給出的各基因型頻率計(jì)算出相應(yīng)人數(shù)。其中對照組中MTHFR C677T各基因型頻率分布應(yīng)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)文獻(xiàn)中未注明樣本人群諸如年齡、民族、生活習(xí)慣等一般信息者；(2)文獻(xiàn)研究中未明確URSA定義者；(3)文獻(xiàn)中未列出各基因型頻數(shù)或頻率者。

1.2 文獻(xiàn)檢索 在檢索過程中，我們并未對文獻(xiàn)語種加以限制，因此同時(shí)利用Pubmed數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)(CNKI)以及萬方數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，前者主要用于檢索國外發(fā)表的英文文獻(xiàn)，而后兩者則用于檢索中文相關(guān)文獻(xiàn)。在Pubmed中，我們利用下列關(guān)鍵詞對相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索：〔mthfr OR methylenetetrahydrofolate reductase(MeSH Terms)〕 AND 〔abortion(MeSH Terms) OR miscarriage(MeSH Terms)OR fetal loss OR pregnancy loss〕。在CNKI和萬方數(shù)據(jù)庫中則鍵入“MTHFR”(或“5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶”)和“流產(chǎn)”搜索相關(guān)中文文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)篩檢與數(shù)據(jù)提取 嚴(yán)格按照上述標(biāo)準(zhǔn)對從各數(shù)據(jù)庫中檢索出的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了篩選，同時(shí)采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)量表對篩選后所有入選文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，包括病例的定義是否充分、病例的代表性、對照的選擇、對照的定義及可比性，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)滿分為9分。從每篇入選文獻(xiàn)中提取了文獻(xiàn)作者、發(fā)表年限、病例組和對照組中分別所包含的研究對象的個(gè)數(shù)外，對開展研究所在的國家、病例組中個(gè)體的流產(chǎn)次數(shù)和發(fā)生時(shí)間以及研究對象的入選標(biāo)準(zhǔn)等信息也進(jìn)行了提取，因此有助于解釋各獨(dú)立研究結(jié)果之間的異質(zhì)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 首先以O(shè)R值及其95%CI來分別表示各入選文獻(xiàn)中記載的URSA與MTHFR基因突變之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，即在URSA病例組與健康對照組之間分別以突變純合型(TT)個(gè)體數(shù)與野生型(CC)個(gè)體數(shù)、突變雜合型(CT)個(gè)體數(shù)與野生型(CC)個(gè)體數(shù)、T等位基因攜帶者(TT+CT)個(gè)體數(shù)與野生型(CC)個(gè)體數(shù)、突變純合型(TT)個(gè)體數(shù)與C等位基因攜帶者(CT+CC)個(gè)體數(shù)以及T等位基因頻數(shù)與C等位基因頻數(shù)計(jì)算OR值及其95%CI。然后，再以固定效應(yīng)模型或隨機(jī)效應(yīng)模型對上述OR值進(jìn)行加權(quán)合并計(jì)算出最后的合并OR值和95%CI。在異質(zhì)性檢驗(yàn)中，我們主要利用Q檢驗(yàn)對各獨(dú)立研究結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)：若P<0.05,則說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此時(shí)應(yīng)改用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并。除此之外，我們還可通過I2值對異質(zhì)性的大小進(jìn)行評價(jià)，I2值的取值范圍在0%～100%之間，當(dāng)I2值為0%代表各獨(dú)立研究結(jié)果間無異質(zhì)性，各研究結(jié)果間的異質(zhì)性越大，則I2值也隨之增大[7]。本次研究中我們還進(jìn)行了按不同種族和地區(qū)分層分析，這樣不僅可以降低各獨(dú)立研究間的異質(zhì)性，而且還可對中國人群進(jìn)行重點(diǎn)分析。我們利用Begg等[8]提出的秩相關(guān)檢驗(yàn)及Egger等[9]提出的線性回歸法對本次研究中存在的發(fā)表偏倚進(jìn)行評價(jià)。之所以沒有單一通過肉眼觀察漏斗圖的方式對發(fā)表偏倚進(jìn)行評價(jià)是因?yàn)楦鳘?dú)立研究的方法學(xué)質(zhì)量參差不齊，即存在異質(zhì)性也是導(dǎo)致漏斗圖不對稱的原因之一，因此也就無法對發(fā)表偏倚做出合理評價(jià)[10]。本次研究中的所有統(tǒng)計(jì)分析均采用Stata 11.0軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果 首次檢索共檢出94篇相關(guān)文獻(xiàn)(中文26篇，英文68篇)。對此94篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步篩選，其中有30篇文獻(xiàn)(中文6篇，英文24篇)并未涉及母體MTHFR C677T突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)或未進(jìn)行相關(guān)的病例對照研究。在余下的64篇文獻(xiàn)中，有英文文獻(xiàn)23篇未具體注明病例組和對照組中各基因型人數(shù)，予以剔除。此外，還有2篇未注明流產(chǎn)次數(shù)(中文1篇，英文1篇)的文獻(xiàn)[11-12]和1篇定義流產(chǎn)次數(shù)為大于等于一次的英文文獻(xiàn)[13]，為盡量縮小本次研究中各獨(dú)立研究之間的異質(zhì)性，且嚴(yán)格遵循URSA的定義，決定予以剔除。在進(jìn)一步剔除了15篇(中文10篇，英文5篇)完全重復(fù)的或僅所包含數(shù)據(jù)重復(fù)的文獻(xiàn)(對于后者我們選取對研究對象特征描述相對全面，相關(guān)數(shù)據(jù)分析更為細(xì)致的文獻(xiàn)納入研究)后，我們得到了23篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)(中文9篇，英文14篇)[14-36]。最后，對該23篇符合標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中對照組基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，除文獻(xiàn)[36]外，其他所有22篇文獻(xiàn)中對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，并最終納入本次Meta分析中(見表1)。

表1 所有入選文獻(xiàn)相關(guān)信息

2.2 納入文獻(xiàn)方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)結(jié)果 所納入的22篇文獻(xiàn)文獻(xiàn)均符合之前制定的篩選標(biāo)準(zhǔn),且NOS量表得分均為9分。

2.3 Meta分析結(jié)果

2.3.1 整體分析結(jié)果 所有22篇文獻(xiàn)中共包括URSA患者2 198人，正常對照2 612人。在對各文獻(xiàn)中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并，異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述4組數(shù)據(jù)中各獨(dú)立研究之間均存在異質(zhì)性(P<0.05)，因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型(即DerSimonian and Laird Method)進(jìn)行合并分析。分析結(jié)果顯示，基因型為TT和CT的女性其發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較基因型為CC者分別高93%和22%，即OR值分別為1.93〔95%CI(1.39,2.68)〕 (見圖1)、1.22〔95%CI(0.99,1.50)〕；基因型為TT或CT的女性其發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較基因型為CC者高36%，即OR值為1.36〔95%CI(1.10,1.67)〕(見圖2)；T等位基因攜帶者發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較C等位基因攜帶者高34%，即OR值為1.34〔95%CI(1.14,1.58)〕(見圖3)。Begg秩相關(guān)檢驗(yàn)(P=0.236)及Egger線性回歸法(P=0.111)的檢驗(yàn)結(jié)果均顯示本次研究中無發(fā)表偏倚存在。

2.3.2 按種族地區(qū)分層分析 我們還分別對關(guān)于中國人群的9篇文獻(xiàn)和針對除中國外其他國家人群13篇文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。所有9篇有關(guān)中國人群的文獻(xiàn)中共包括URSA患者892人，正常對照930人?？俆T基因型頻率在正常對照組中為12.58%(117/930)，總T等位基因頻率為 34.09%(634/1 860)。在對各文獻(xiàn)中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并，異質(zhì)性檢驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)上述4組數(shù)據(jù)中的各獨(dú)立研究之間存在異質(zhì)性(P值分別為0.924、0.164、0.703、0.948)，因此采用固定效應(yīng)模型(即Mantel and Haenszel Method)進(jìn)行合并分析。分析結(jié)果顯示，基因型為TT和CT的女性其發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較基因型為CC者分別高267%和62%，即OR值分別為3.67〔95%CI(2.68，5.03)〕(見圖4)、1.62〔95%CI(1.29，2.05)〕；基因型為TT或CT的女性其發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較基因型為CC者高105%，即OR值為2.05〔95%CI(1.65，2.55)〕(見圖5)；T等位基因攜帶者發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)較C等位基因攜帶者高89%，即OR值為1.89〔95%CI(1.64，2.18)〕(見圖6)。Begg秩相關(guān)檢驗(yàn)(P=0.917)及Egger線性回歸法(P=0.517)的檢驗(yàn)結(jié)果均顯示本次研究中無發(fā)表偏倚存在。

注：MTHFR=5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，URSA=原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

圖1 MTHFR基因型TT與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure1 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR

圖2 MTHFR基因型TT+CT與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure2 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR

圖3 MTHFR基因型T等位基因與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure3 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR

圖4 中國人群MTHFR基因型TT與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure4 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT genotype of MTHFR among Chinese people

圖5 中國人群MTHFR基因型TT+CT與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure5 The forest plot of the relationship between the URSA and the TT or CT genotype of MTHFR among Chinese people

圖6 中國人群MTHFR基因型T等位基因與URSA發(fā)生Meta分析森林圖

Figure6 The forest plot of the relationship between the URSA and the T allele of MTHFR among Chinese people

所有13篇來自除中國以外的其他國家的文獻(xiàn)中共包括URSA患者1 306人，正常對照1 682人。在對各文獻(xiàn)中TT與CC、CT與CC、TT+CT與CC以及等位基因T與C之間的OR值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并，異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述四組數(shù)據(jù)中除等位基因T與C之間比較外，其余三組數(shù)據(jù)中的各獨(dú)立研究之間均不存在異質(zhì)性(P值分別為0.081、0.089、0.052、0.023)。然而，合并結(jié)果顯示各基因型的分布在URSA組和正常對照組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即MTHFR C677T突變與URSA發(fā)病之間并無關(guān)聯(lián)。Begg秩相關(guān)檢驗(yàn)(P=0.246)的檢驗(yàn)結(jié)果顯示本次研究中無發(fā)表偏倚存在，而Egger線性回歸法(P=0.150)的檢驗(yàn)結(jié)果則顯示存在發(fā)表偏倚。

3 討論

MTHFR基因位于染色體1q36.3，目前已發(fā)現(xiàn)人類MTHFR有15種點(diǎn)突變類型，其中最重要的是第五個(gè)外顯子上677位點(diǎn)發(fā)生突變，即C677T突變。該位點(diǎn)C等位基因突變?yōu)門等位基因，使原編碼丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val)，進(jìn)而可影響酶的熱敏感性，以及導(dǎo)致酶活性的下降，進(jìn)而導(dǎo)致了5-甲基四氫葉酸濃度降低，血漿中同型半胱氨酸增高[3-4]。血漿中同型半胱氨酸增高可產(chǎn)生大量的過氧化物和氧自由基，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的合成和釋放導(dǎo)致血管功能異常和內(nèi)皮細(xì)胞受損。高同型半胱氨酸水平還可激活凝血因子XII和V，降低抗凝血因子III、IV的活性，抑制和干擾內(nèi)皮細(xì)胞對硫酸肝素的合成，明顯減弱其抗凝作用，使血小板功能受損和血栓素A2(TXA2)產(chǎn)生增加，破壞機(jī)體凝血與纖溶之間的平衡，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)，加速了動脈粥樣硬化和動脈血栓的形成。如果胎盤動脈出現(xiàn)栓塞，則可引發(fā)胚胎供血不足、絨毛壞死，進(jìn)而造成自然流產(chǎn)的發(fā)生[37]。

Ren 等[38]曾于2006年對1997—2005年發(fā)表的關(guān)于MTHFR C677T突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)的21篇英文文獻(xiàn)和5篇中文文獻(xiàn)進(jìn)行過一次Meta分析，并得出結(jié)論MTHFR C677T基因突變僅在中國人群中才與URSA發(fā)病相關(guān)，而在其他種族和地區(qū)人群中與該疾病的發(fā)生并無關(guān)聯(lián)。然而，該Meta分析所囊括的中文文獻(xiàn)數(shù)量較少，也未針對中文文獻(xiàn)制定相關(guān)檢索策略，因此本次研究中所包括的中文文獻(xiàn)數(shù)量達(dá)到9篇之多，旨在重點(diǎn)而且更為系統(tǒng)地針對中國人群中的MTHFR C677T突變與URSA發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行評價(jià)。

我們在對全部22篇文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并后所得結(jié)果顯示，MTHFR C677T突變與URSA發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)，然而在除中國以外的其他國家中并未發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因突變與URSA發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)。由此可見，全部22篇文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并后得到MTHFR C677T突變與URSA發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)的結(jié)果主要是由其中的9篇中文文獻(xiàn)引起的。相關(guān)研究曾發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因型的分布在不同國家，同一國家的不同地區(qū)，同一地區(qū)的不同種族中的分布有差異，其中亞洲人群中T等位基因頻率為2.5%～33%[39]，歐洲人群中T等位基因頻率最高(24%～40%)[40]，非洲最低(4.9%～9.1%)[39]。在本次Meta分析所包含的9篇中文文獻(xiàn)中，總TT基因型頻率在正常對照組中為12.58%，總T等位基因頻率為 34.09%，因此從本次研究所得數(shù)據(jù)可以看出中國健康女性人群中T等位基因攜帶者的比例明顯高于總體亞洲人群的范圍，故除了URSA外，還應(yīng)在中國女性人群中積極預(yù)防新生兒神經(jīng)管畸形，妊娠高血壓綜合征等其他與MTHFR C677T點(diǎn)突變相關(guān)的疾病。

URSA的發(fā)病還與體內(nèi)葉酸水平降低有關(guān)[41]，其水平下降直接導(dǎo)致體內(nèi)甲基供體，即5-甲基四氫葉酸的不足，進(jìn)而引發(fā)同型半胱氨酸水平的升高。盡管近年來中國廣泛實(shí)施對圍孕期婦女增補(bǔ)葉酸的政策，但由于人口基數(shù)大、地理位置偏遠(yuǎn)以及飲食習(xí)慣和文化水平差異等因素的影響，很多地區(qū)尤其是北方婦女體內(nèi)葉酸仍然嚴(yán)重缺乏，因此葉酸補(bǔ)給不足也可導(dǎo)致URSA的發(fā)生，即成為MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA之間關(guān)聯(lián)的一個(gè)混雜因素。賀憲民等[42]曾對中國南方和北方女性的MTHFR C677T各基因型的頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，TT基因型在北方和南方女性人群中的頻率分別為37.35%和10.44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合本次研究結(jié)果可推測北方女性對于URSA的易感性更強(qiáng)。本次研究所包含的9篇中文文獻(xiàn)中除2篇來自南方城市外，其他7篇均來自北方，可見URSA發(fā)病頻率在北方明顯高于南方，故應(yīng)加強(qiáng)對北方女性人群實(shí)施增補(bǔ)葉酸等相關(guān)的預(yù)防策略。

盡管在本次研究中我們嚴(yán)格規(guī)定了所有檢索出的相關(guān)文獻(xiàn)的入選標(biāo)準(zhǔn)，Begg秩相關(guān)檢驗(yàn)及Egger線性回歸法的檢驗(yàn)結(jié)果均顯示無發(fā)表偏倚存在(除對中國以外的13篇文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并外)，但與其他所有系統(tǒng)分析一樣，本次分析在納入文獻(xiàn)方面實(shí)際上仍然存在一定的局限性。在檢索相關(guān)文獻(xiàn)的過程中我們僅通過Pubmed、萬方以及CNKI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，這就不免會遺漏某些未發(fā)表文獻(xiàn)。此外，入選的文獻(xiàn)數(shù)量有限，對于RSA的次數(shù)和時(shí)間的定義不盡相同，而且所使用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備器材的規(guī)格和精確度參差不齊，對研究對象制定的入選標(biāo)準(zhǔn)之間也存在較大差異。有此類混雜因素存在，勢必會對最后合并的統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成影響。但盡管如此，本次綜合分析所得出的結(jié)果具有重要參考價(jià)值，尤其對中國資料分析顯示的MTHFR C677T基因突變與URSA之間的高度關(guān)聯(lián)應(yīng)引起關(guān)注。

綜上所述，本研究得出結(jié)論，在中國女性人群中，MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)，而在其他國家地區(qū)的人群中并未發(fā)現(xiàn)該危險(xiǎn)因素與URSA之間的關(guān)聯(lián)。但由于所入選文獻(xiàn)之間異質(zhì)性無法完全消除，諸多混雜因素均可對本次研究結(jié)果產(chǎn)生影響，其中針對中國人群的相關(guān)研究所得出的陰性結(jié)果極少被報(bào)道最有可能導(dǎo)致本次研究的結(jié)果為假陽性。因此，今后在本次研究的基礎(chǔ)上應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究，以便進(jìn)一步探究MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而在該病病因?qū)W上有所突破。

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