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        Citrin缺陷引起的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥兩例臨床特點(diǎn)及家系基因分析

        2013-04-20 03:22:45閆秀梅黃開宇李云芳胡偉國張春花鄭必霞
        中國全科醫(yī)學(xué) 2013年29期
        關(guān)鍵詞:淤積膽汁血癥

        閆秀梅,黃開宇,李云芳,胡偉國,張春花,鄭必霞,郭 惟

        Citrin缺陷引起的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency,NICCD)是SLC25A13基因突變導(dǎo)致位于線粒體內(nèi)膜的載體蛋白Citrin功能不足而形成的一種遺傳代謝病[1]。以黃疸、肝功能異常并伴有高瓜氨酸血癥、高乳酸血癥、高氨血癥、半乳糖血癥、酪氨酸血癥、低蛋白血癥等為主要臨床表現(xiàn)[2]。其致病基因SLC25A13由日本鹿兒島大學(xué)Kobayashi等[3]于1999年定位克隆,而臨床患者則由Ohura等[4]和Tazawa等[5]在2001年最初報道,之后鹿兒島大學(xué)又陸續(xù)檢測出了巴勒斯坦、以色列、韓國、中國(包括臺灣地區(qū))、捷克、美國、英國等國家的患者。國內(nèi)首例NICCD的確診見于2006年[6],近5年在我國已有100余例相關(guān)報道,但目前罕見該病家系基因表型分析報道。我科收治2例經(jīng)基因檢測確診的NICCD患兒,并予家系基因分析,現(xiàn)報道如下。

        1 病例簡介

        表1SLC25A13基因6個片段引物設(shè)計片段包含突變引物序列、退火溫度及片段長度

        Table1The six segment primer of SLC25A13 gene include the sequence of mutational primer,annealing temperature and the segment length

        外顯子     引物序列退火溫度(℃)片段長度(bp)Exon6E:5′-TGAGGGCTTGTTAGATCAAGAT-3′F:5′-TTACCCAGACAACAAATTAACCT-3′60467Exon7E:5′-CATGATTAGTTGCAGTTGCT-3′F:5′-ATAGTTAATATGTGTCAATG-3′55447Exon8,9E:5′-TCACTCATTCCAGTGCCTTG-3′F:5′-CAATGCCGCAAAGGCAACTG-3′63556Exon10F:5′-ACCGTGCCTGGCCTCAGTGATG-3′R:5′-TTTACTCTTGCCCTACCCACA-3′62554Exon11E:5′-TTGGGCTGTAGCAATGTGCC-3′F:5′-CTAGATGCCTCCAGCCTACT-3′63557Exon13E:5′-CTCCTGAAACATCAGTGATGC-3′F:5′-CCTAGTAGACTCTGCCCTTG-3′61433Exon16,17E:5′-GAGAATGTGACCAGACTGAGAT-3′F:5′-CTTTCCCTACGACAACAGAGCA-3′60453

        注:a=雜合突變[Ⅰ]851del4;b=雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

        圖1雜合突變[Ⅰ]851del4和雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

        Figure1Heterozygous mutation[Ⅰ]851del4 and[Ⅱ]IVS11+IG>A

        例1:女,出生42 d。溫州人,生后混合喂養(yǎng)。母孕史無異常,足月剖宮產(chǎn),出生體質(zhì)量2.7 kg。父母均系溫州人,體健。兩系三代否認(rèn)家族性及遺傳性疾病。此次因“腹瀉半個月,皮膚黃染3 d”于2010-07-04入住我科。入院查體:皮膚蒼黃,鞏膜輕度黃染,心前區(qū)Ⅲ級收縮期雜音,腹平軟,肝肋下1.5 cm,劍突下1 cm,質(zhì)軟,邊銳,余無異常。實(shí)驗室檢查:轉(zhuǎn)氨酶升高,膽紅素雙向升高,血常規(guī)提示中度貧血,凝血功能基本正常,甲胎蛋白明顯升高。

        例2:男,出生95 d。溫州人,生后配方奶粉喂養(yǎng)。母孕史無異常,孕1產(chǎn)1,足月順產(chǎn),出生體質(zhì)量3.0 kg。父母系溫州泰順人,體健。兩系三代否認(rèn)家族性及遺傳性疾病。因“皮膚、鞏膜黃染3個月,發(fā)現(xiàn)肝功能異常1 d”于2012-02-12收住我科。入院查體:皮膚、鞏膜中度黃染,腹軟,肝肋下5.0 cm,劍突下0.5 cm,質(zhì)軟,邊銳,余無異常。入院后查血常規(guī)提示輕度貧血,肝功能提示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶輕度升高,膽紅素雙向升高,以直接膽紅素升高為主,凝血功能正常,甲胎蛋白明顯升高。

        2 基因檢測方法

        2.1DNA提取剪取0.5 mm×0.5 mm大小血片樣,用DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Kit(Promega Corporation,USA)抽提基因組DNA,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒protocol。

        2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)中報道的12種已知突變在基因上的分布位置[7],將其所在區(qū)域分成6個片段擴(kuò)增,應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5分別為6個片段設(shè)計引物,由Invitrogen(英駿)公司合成。引物設(shè)計見表1。

        PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸30 s,40次循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。

        2.3抽提PCR產(chǎn)物用TIANGEN凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD,BEIJING)抽提PCR產(chǎn)物。

        2.4DNA序列測定及分析以BigDye Terminator(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA,USA)進(jìn)行產(chǎn)物標(biāo)記,精制純化后用ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)測序。測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行BLAST比較。

        3 診斷結(jié)果與治療措施

        例1結(jié)果:尿代謝檢查高度提示酪氨酸血癥或Citrin缺陷癥。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA,對SLC25A13基因行PCR和產(chǎn)物測序,結(jié)果與參考序列比對,分析表明患兒基因型:851del4/851del4純合突變,患兒父親基因型:851del4/——攜帶者,母親基因型:851del4/——攜帶者。治療:食用無乳糖和加強(qiáng)中鏈脂肪酸的配方奶粉,補(bǔ)充多種脂溶性維生素,熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪2.5個月,患兒黃疸消退,血生化基本恢復(fù)正?!,F(xiàn)患兒2周歲,生長發(fā)育良好,無黃疸。

        例2結(jié)果:尿代謝結(jié)果提示半乳糖血癥以及Citrin缺陷癥待除外。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA,對SLC25A13基因行PCR和產(chǎn)物測序,結(jié)果與參考序列比對,分析表明患兒基因型:[Ⅰ]851del4/[Ⅱ]IVS11+IG>A的復(fù)合變異,患兒父親基因型:[Ⅱ]IVS11+IG>A/——攜帶者,母親基因型:[Ⅰ]851del4/——攜帶者(見圖1)。治療:食用無乳糖和加強(qiáng)中鏈脂肪酸的配方奶粉,補(bǔ)充多種脂溶性維生素,熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪1個月,肝功能正?!,F(xiàn)患兒1歲,生長發(fā)育良好。

        4 討論

        NICCD的致病基因SLC25A13位于染色體7q21.3,包含18個外顯子,長200 kb,編碼一種線粒體內(nèi)鈣結(jié)合天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白Citrin。SLC25A13基因突變所導(dǎo)致的Citrin缺陷癥在兒童期表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積癥和黃疸,稱為NICCD[8];而在成人期表現(xiàn)為高氨血癥、突發(fā)的意識障礙、精神錯亂等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,稱為成年發(fā)病的Ⅱ型瓜氨酸血癥(adult onset type Ⅱ citrullinemia,CTLN2)。NICCD在遺傳代謝病高?;颊咧嘘栃月示拥?位,僅次于甲基丙二酸血癥[9]。在臨床實(shí)踐中隨著NICCD患兒數(shù)的不斷增加,該病日益受到臨床醫(yī)生的重視。NICCD患兒目前尚缺乏成熟的臨床或者生化診斷標(biāo)準(zhǔn),所以現(xiàn)階段應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)SLC25A13基因診斷的必要性。截至2012年4月,日本鹿兒島大學(xué)Kobayashi領(lǐng)導(dǎo)的課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SLC25A13基因的54種突變類型,包括13種無義,17種錯義,5種插入,5種缺失,14種剪切突變。已發(fā)表的突變類型中有12種被作為分子流行病學(xué)常規(guī)篩查手段,結(jié)果顯示851del4和IVS11+lG>A在日本人中常見,而851del4、1638ins23和IVS6+5G>A則在中國人中多見[10]。我國NICCD診斷治療研究起步較晚,尚缺乏大樣本、多中心的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論。本研究2例患兒均為溫州籍人,突變類型分別為851del4、[Ⅰ]851de14/[Ⅱ]IVS11+lG>A,與以往文獻(xiàn)報道稍有不符。

        本研究2例患兒均表現(xiàn)黃疸、肝大等癥狀,實(shí)驗室檢查均有高膽紅素血癥、肝功能異常、甲胎蛋白明顯升高、貧血以及血氨升高等改變。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的升高提示患兒肝細(xì)胞有不同程度受損,高膽紅素血癥和堿性磷酸酶升高提示患兒存在膽汁淤積。NICCD是一種在亞洲地區(qū)較為常見的遺傳代謝病,以往研究認(rèn)為NICCD患兒可通過代償適應(yīng)使其臨床癥狀于1歲左右自行緩解。Ohura等[11]對75例NICCD患兒的回顧性研究發(fā)現(xiàn),僅2例患兒肝功能持續(xù)惡化并分別于5個月和10個月行肝移植術(shù)。本研究2例患兒均預(yù)后良好。雖然NICCD多數(shù)可自行緩解,但嚴(yán)重者可出現(xiàn)多種并發(fā)癥如營養(yǎng)不良、生長發(fā)育障礙、白內(nèi)障、凝血功能障礙甚至肝衰竭,部分可轉(zhuǎn)化為CTLN2[12],預(yù)后不良,故早期診斷NICCD是非常重要的。第一,可以對新生兒進(jìn)行篩查早期診斷,Ohura等[11]通過臨床回顧性分析發(fā)現(xiàn),日本診斷的NICCD患者約40%是在新生兒篩查中發(fā)現(xiàn)異常指標(biāo);第二,對有家族史的高危胎兒進(jìn)行胎內(nèi)診斷[13];第三,對患膽汁淤積性肝病的患兒早做出NICCD的診斷。鑒于NICCD臨床表現(xiàn)及實(shí)驗室檢查無特異性,且為一過性,患者往往在4~6個月齡后逐漸恢復(fù)正常,有學(xué)者強(qiáng)烈建議相關(guān)的檢查應(yīng)盡可能在4個月齡前進(jìn)行[14],包括臨床生化、尿氣相色譜氨基酸(GC-MS)分析、血串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)分析篩查,確診有賴于SLC25A13突變基因檢測,如基因檢測與Citrin蛋白檢測相結(jié)合,可以有效彌補(bǔ)基因分析的不足之處,更有利于疾病診斷。NICCD治療以飲食控制為主。NICCD患兒通過停止母乳喂養(yǎng),改換無乳糖和強(qiáng)化中鏈脂肪酸的特殊配方奶粉,并補(bǔ)充多種脂溶性維生素,癥狀可獲改善。雖然一些NICCD患兒未經(jīng)過特殊治療臨床表現(xiàn)也漸緩解,但亦有NICCD 患兒病情嚴(yán)重而不得不接受肝臟移植,甚至夭折[15-16]。

        近來國內(nèi)兒科界對于此病的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗室檢查異常開始有一定的認(rèn)識,北京、上海和廣州等中心城市的部分醫(yī)院也陸續(xù)成功診斷NICCD患兒,但是從總體上講,本病診治知識的推廣普及還需進(jìn)一步加強(qiáng),分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究開展還不多,所發(fā)現(xiàn)的SLC25A13基因突變種類尤其是新突變種類還相當(dāng)有限。因此,我國醫(yī)學(xué)界同仁應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)協(xié)作,積極開展SLC25A13基因突變研究,建立相應(yīng)的分子診斷方法,更快更好地服務(wù)廣大NICCD患者。

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