胡旭昌，王栓科，康學(xué)文，張海鴻，汪 靜，萬 麟，安麗萍，劉文忠，馬靖琳，王翠芳

骨肉瘤是最常見的人類惡性腫瘤，盡管應(yīng)用化療、放療、手術(shù)治療骨肉瘤在過去幾十年取得了很大的進(jìn)步，但并未顯著提高本病的治愈率，尤其是多學(xué)科綜合治療后肺轉(zhuǎn)移的問題，15%～25%的患者需重新化療和切除轉(zhuǎn)移灶[1-2]。吉西他濱具有廣譜抗腫瘤活性[3]，對多種腫瘤細(xì)胞在體外表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用[4-5]。本研究通過觀察吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株在體外的抗腫瘤作用，探討其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抑制人骨肉瘤細(xì)胞系腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MTA1)mRNA表達(dá)的作用，為有效治療骨肉瘤提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑吉西他濱(哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM/F12(武漢博士德生物工程有限公司)，青霉素、鏈霉素(哈爾濱制藥集團(tuán)有限公司)，二甲亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、實(shí)時定量試劑盒(Takara公司)。

PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。人β-actin引物序列：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；人MTA1序列：上游引物5′-CGGCATCCATGCTGCTCTTA-3′，下游引物5′-ACTGGTCGATCTGCTTGTCTGTG-3′。

1.1.3主要儀器二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱、臺式低溫高速離心機(jī)(Heraeus公司)，超純水儀(USFELGA公司)，臺式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)，磁力攪拌器(WerkeGmbHCOKG公司)，酶標(biāo)儀(Hyperion公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)，熒光定量PCR儀(Bioneer公司)。

1.2方法

1.2.1MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)于10%特級胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞鋪至70%～80%時，在超凈臺內(nèi)進(jìn)行傳代。

1.2.2MTT法檢測吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞完全貼壁。然后加入含有不同濃度的吉西他濱(0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)培養(yǎng)基和DMSO，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。作用24 h后停止干預(yù)，加入MTT，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后中止，充分溶解結(jié)晶。用全自動酶標(biāo)儀在570 nm檢測各孔吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)組A值。抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值×100%，計算出標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3RT-PCR測定MTA1 mRNA的表達(dá)選取對數(shù)生長期的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞約0.5×106個，培養(yǎng)12 h后給予不同濃度的吉西他濱(0.100、0.200、0.400 mg/L)作用后，每個劑量組設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)空白對照組。培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴(kuò)增目的基因。利用實(shí)時定量熒光PCR儀得到Ct值，通過以下?lián)Q算方法得到實(shí)驗(yàn)組mRNA相對表達(dá)量：2-△△Ct，△△Ct=△CtT-△CtP=(CtT-CtTE)-(CtP-CtPE)，CtT、CtTE、CtP、CtPE分別為實(shí)驗(yàn)組Ct值、實(shí)驗(yàn)組平均Ct值、內(nèi)參(β-actin)Ct值、內(nèi)參平均Ct值。

2　結(jié)果

2.1吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響不同濃度吉西他濱(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中0.025、0.050 mg/L組抑制率均低于其他3組，0.100、0.200 mg/L組亦低于0.400 mg/L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2吉西他濱對MTA1 mRNA表達(dá)的影響吉西他濱作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞24 h后，經(jīng)實(shí)時定量PCR檢測，0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達(dá)量分別為(0.86±0.16)、(0.68±0.12)、(0.46±0.08)，空白對照組MTA1 mRNA相對表達(dá)量為(1.01±0.15)，4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.722，P=0.0093)；其中0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達(dá)量均低于空白對照組，且3個劑量吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達(dá)量依次降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1)。

Table1Inhibition ratios of MG-63 cells treated with varying concentrations of gemcitabineon(after 24 h)

吉西他濱濃度(mg/L)MG-63細(xì)胞抑制率0 025　3 3±1 2　　　　　0 050　3 7±1 0　　　　　0 100　6 1±0 1?△　　　0 200　8 0±1 9?△　　　0 40011 5±1 4?△▲☆F值30 568P值0 0169

注：與0.025 mg/L組比較，*P<0.05；與0.050 mg/L組比較，△P<0.05；與0.100 mg/L組比較，▲P<0.05；與0.200 mg/L組比較，☆P<0.05

注：1、2、3、4分別為空白對照組及0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組；MTA1=腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1

圖1不同濃度吉西他濱作用MG-63細(xì)胞后MTA1 mRNA的相對表達(dá)量

Figure1Effects of gemcitabineon on the mRNA expression of MTA1 in MG-63 cells

3　討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能抑制骨肉瘤細(xì)胞生長，使細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可以與多西紫杉醇、卡鉑等多種化療藥聯(lián)合使用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增加抗腫瘤作用[6-7]；此外，其還可以增加放射治療的效果[8]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞毒性藥物治療的一種主要方式，本研究結(jié)果顯示吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的生長有抑制作用，并且呈劑量依賴性——0.025、0.050 mg/L吉西他濱作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制率均低于0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱，且0.100、0.200 mg/L吉西他濱作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制率亦低于0.400 mg/L吉西他濱。有報道稱吉西他濱對腫瘤細(xì)胞的增殖阻滯可能與p53、p21的表達(dá)有關(guān)[9]，也有研究認(rèn)為吉西他濱誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡可能是通過Fas/FasL的死亡受體途徑[10]。

骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移早，給臨床治療帶來了很大困難，其最常見的轉(zhuǎn)移部位是肺，這可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)。MTA1是一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，其表達(dá)的增高與腫瘤轉(zhuǎn)移有直接的相關(guān)性，在多種轉(zhuǎn)移癌組織中都可檢測出MTA1的高表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、大腸癌等[11]。有研究表明，MTA1可以明顯增加MG-63細(xì)胞株的侵襲能力[12]。本研究采用實(shí)時定量PCR檢測人骨肉瘤MG-63細(xì)胞MTA1 mRNA的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱干預(yù)24 h后，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞MTA1 mRNA相對表達(dá)量降低，從而證明吉西他濱可能通過降低MTA1 mRNA的表達(dá)來抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。故MTA1在抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移基因治療機(jī)制中的作用值得進(jìn)一步研究[13]。

綜上所述，吉西他濱能抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖，且有劑量依賴性；其作用機(jī)制可能是通過抑制MTA1 mRNA的表達(dá)，從而抑制MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這為骨肉瘤的治療提供了新的可能。

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