劉月平，王小玲，張 勐，張玲玲，楊會(huì)釵，陳硯凝

賁門(mén)癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。河北省是賁門(mén)癌的高發(fā)區(qū)，其病死率已居國(guó)內(nèi)第2位，然而其病因至今仍不十分清楚。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病的生物學(xué)基礎(chǔ)與腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell，TSC)密切相關(guān)，與諸多惡性腫瘤一樣更傾向于它是一種干細(xì)胞疾病。

TSC是腫瘤中有自我更新能力且在分化增殖過(guò)程中逐漸具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞。腫瘤被認(rèn)為是一種干細(xì)胞疾病[1]，賁門(mén)腺癌的增殖分化取決于存在癌組織中的少量TSC。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ABCG2)是ABC家族的G2成員[2]，是公認(rèn)的TSC標(biāo)志物，它參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化及腫瘤的多藥耐藥機(jī)制[3]，它的高表達(dá)對(duì)患者的化療及預(yù)后有著不良影響。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在許多惡性上皮性腫瘤中廣泛表達(dá)，如食管癌、賁門(mén)癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及卵巢癌等，而在許多良性腫瘤中不表達(dá)或微量表達(dá)，這些都提示了ABCG2有可能參與腫瘤的惡性過(guò)程。CD24屬糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是P-選擇素配體的黏附分子，它由27個(gè)氨基酸組成,通過(guò)糖基磷脂酰肌醇黏附在細(xì)胞膜上[4]，參與正常組織結(jié)構(gòu)的成熟、發(fā)育。Smith等[5]研究發(fā)現(xiàn)CD24在上皮和間質(zhì)來(lái)源的腫瘤增殖中起關(guān)鍵的作用，近年來(lái)研究證實(shí)CD24在卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及胰腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，特別是在惡性消化道上皮腫瘤中表達(dá)率高，如食管癌、胃癌、大腸癌等，因此CD24極有可能是TSC標(biāo)志物之一。本研究旨在探討ABCG2和CD24在賁門(mén)腺癌中的表達(dá)情況及其是否與賁門(mén)腺癌的惡性過(guò)程有關(guān)，為賁門(mén)腺癌的早期診斷和預(yù)后判定提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2010年1—10月賁門(mén)腺癌手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊共155例，其中賁門(mén)腺癌組織140例，癌旁組織15例，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。140例患者中男120例，女20例；年齡40～80歲，中位年齡62歲；低分化56 例，中高分化84例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者77例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例；浸潤(rùn)深度：侵及固有層(T0)1例，固有層及黏膜下層(T1)14例，肌層(T2)25例，漿膜(T3)44例，周?chē)浗M織(T4)56例；臨床分期〔TNM分期標(biāo)準(zhǔn)參照2012年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)診療規(guī)范〕：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分別為26例、65例、44例、5例；Lauren分型[6]：腸型119例，彌漫型21例；所有患者術(shù)前未進(jìn)行任何治療且術(shù)后病理證實(shí)為腺癌。

1.2主要試劑ABCG2鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鼠抗人CD24多克隆抗體購(gòu)自上海邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，免疫組化Maxvision2/HRP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。每次染色均同步設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。ABCG2陽(yáng)性對(duì)照為胎盤(pán)組織，CD24陽(yáng)性對(duì)照為扁桃體。

1.3方法采用免疫組化SP法測(cè)定ABCG2 和CD24在賁門(mén)腺癌中的表達(dá)情況。10%甲醛溶液固定石蠟包埋組織，連續(xù)4 μm 厚切片，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行SP 染色，分別用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代第一抗體作為替代對(duì)照和空白對(duì)照。

1.4陽(yáng)性結(jié)果的判斷ABCG2 與CD24蛋白均定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性表現(xiàn)為瘤細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的、定位準(zhǔn)確的淡黃色至棕黃色顆粒。高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察，染色強(qiáng)度0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色顆粒，3分為棕褐色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞<10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分相乘，乘積>3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行處理；蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ABCG2的免疫組化結(jié)果

2.1.1ABCG2在癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況賁門(mén)腺癌組織中ABCG2的陽(yáng)性表達(dá)率為54.3%(76/140，見(jiàn)圖1)，癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為13.3%(2/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.089，P<0.05)。

2.1.2ABCG2表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系A(chǔ)BCG2 的陽(yáng)性表達(dá)率與賁門(mén)腺癌的分化程度、Lauren分型有相關(guān)性(P<0.01)，與患者的年齡、性別、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.2CD24的免疫組化結(jié)果

2.2.1CD24在癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況賁門(mén)腺癌組織中CD24的陽(yáng)性表達(dá)率為45.0%(63/140，見(jiàn)圖2)，癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為6.7%(1/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.213，P<0.05)。

圖1　ABCG2在賁門(mén)腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)(SP 400×)

圖2　 CD24在賁門(mén)腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)(SP 400×)

2.2.2CD24表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系CD24的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及Lauren分型有相關(guān)性(P<0.05)，但與患者的年齡、性別均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1　ABCG2和CD24表達(dá)與賁門(mén)腺癌臨床病理特征間的關(guān)系

3　討論

20世紀(jì)80年代至今，世界上許多地區(qū)，如亞洲、歐洲、北美等出現(xiàn)了胃癌發(fā)病率下降的趨勢(shì)，但令人費(fèi)解的是食管癌、賁門(mén)癌的發(fā)病率卻有所上升，歐美國(guó)家過(guò)去以鱗狀細(xì)胞癌為主，如今逐漸演變?yōu)橄侔[癌對(duì)等的趨勢(shì)[7]。在我國(guó)食管胃交界腫瘤中，賁門(mén)腺癌居然占到了80%以上，且賁門(mén)腺癌具有惡性程度高、外侵率高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)[8]，已經(jīng)嚴(yán)重危害到了人們的生存健康。

本研究結(jié)果表明，賁門(mén)腺癌組織中ABCG2、CD24的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織，說(shuō)明兩種分子在賁門(mén)腺癌中具有一定的特異性，有可能參與癌的發(fā)生發(fā)展，并且從正常黏膜發(fā)展到癌，兩者的表達(dá)是一個(gè)上調(diào)的過(guò)程。ABCG2和CD24與賁門(mén)腺癌的病理組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，腫瘤分化差者其TSC數(shù)量多，因此二者陽(yáng)性表達(dá)率也上調(diào)，這也說(shuō)明了這兩種標(biāo)志物與干細(xì)胞的存在密不可分，而分化程度越低的癌組織其惡性程度也越高。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ABCG2參與癌組織的多藥耐藥機(jī)制[2，9]，這種大量表達(dá)于癌組織細(xì)胞膜上的大分子蛋白發(fā)揮著泵的作用，它可有效地將已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外進(jìn)而弱化化療效果，降低患者生存率，因此，即使癌組織分化程度較好，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移，此種分子在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)也應(yīng)引起人們高度警惕。與ABCG2相比CD24更富于侵襲性，由本研究結(jié)果可知，CD24不僅隨腫瘤分化程度的降低、病理組織學(xué)分級(jí)的升高表達(dá)上調(diào)，更重要的是其還與賁門(mén)腺癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期存在相關(guān)性，侵及漿膜或周?chē)浗M織(T3/T4)者CD24的陽(yáng)性表達(dá)率較侵及黏膜層或固有肌層(T0/T2)者高，表明CD24與賁門(mén)腺癌的侵襲性呈正相關(guān)，是腫瘤惡化的證據(jù)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CD24的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，表明CD24上調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

探究賁門(mén)腺癌的形態(tài)學(xué)分化與某種分子是否具有關(guān)聯(lián)性可以更好地使研究方向具體化，為進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究做好鋪墊。探究這兩種標(biāo)志物與腫瘤形態(tài)學(xué)的關(guān)聯(lián)時(shí)我們采用了Lauren分型，腸型一般具有較好的腺管分化，其分化以中高分化為主，也包括一部分低分化形態(tài)，但其特征有別于彌漫型，表現(xiàn)為腺管結(jié)構(gòu)不清但瘤細(xì)胞呈巢團(tuán)狀、索狀分布，而不是彌漫型的散在而廣泛的浸潤(rùn)。在亞洲腸型胃癌患者較彌漫型居多，而彌漫型卻較少受地理位置的影響，但更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后差。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在Lauren分型中彌漫型賁門(mén)腺癌患者癌組織中ABCG2、CD24的陽(yáng)性表達(dá)率均高于腸型的陽(yáng)性表達(dá)率，出現(xiàn)這種結(jié)果有兩種可能性：(1)存在某種分子機(jī)制調(diào)控腺癌向腸型、彌漫型分化，這種機(jī)制所帶來(lái)的結(jié)果是彌漫型ABCG2、CD24表達(dá)高于腸型；(2)彌漫型腺癌幾乎是低分化的，而腸型腺癌包括中高分化腺癌和部分低分化腺癌，二者在彌漫型中的表達(dá)高于在腸型中的表達(dá)，其可能原因是腸型低分化腺癌所占比例較低。因此盡管腸型、彌漫型有差異，但并不能證明在形態(tài)學(xué)分化上具有表達(dá)的差異性。

TSC理論的提出以及近些年來(lái)人們對(duì)TSC表面標(biāo)志物的研究對(duì)諸如賁門(mén)癌等早期癥狀不明顯的惡性腫瘤提供了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的可能性，而對(duì)TSC表面特異性標(biāo)志物的研究又提供了針對(duì)其特異抗原提供有效化療藥物的機(jī)會(huì)。本研究對(duì)TSC標(biāo)志物ABCG2和CD24在賁門(mén)腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為賁門(mén)腺癌的診療提供理論依據(jù)。相信隨著對(duì)TSC的研究，ABCG2和CD24作為T(mén)SC標(biāo)志物將被越來(lái)越多的人所接受。

1Rüdiger Siewert J,Feith M,Werner M,et al.Adenoearcinoma of the esophaogastric junction:resuits of surgical therapy based on anatomical/topographic classification in 1 002 consecutive patients[J].Ann Surg，2000，232(3):353-361.

2Gil J,Stembalska A,Pesz KA,et al.Cancer stem cells:the theory and perspectives in cancer therapy[J].J Appl Genet，2008，49(2):193-199.

3Doyle LA,Yang W,Abruzzo LV,et al.A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells[J].Proc Natl Sci USA,1998,95 (26):15665-15670.

4Allen JD,Schinkel AH.Multidrug resistance and pharmacological protection mediated by the breast cancer resistance protein (BCRP /ABCG2)[J].Mol Cancer Ther,2002,1(6):427-434.

5Smith SC,Oxford G,Wu Z,et al.The metastasis-associated gene CD24is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer[J].Cancer Res,2006,66(4):1917-1922.

6Lauren P.The two histological main types of gastric caicinoma:diffuse and socalled intestinal-type carcinoma.An attempt at a histo-clinical classification[J].Acta Pathol Microbiol Scand,1965,64:31-49.

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8Shaheen NJ.Advances in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma[J].Gastroenterology,2005,128(6):1554-1566.

9Kristiansen G,Sammar M,Altevogt P.Tumour biological aspects of CD24,a mucin-like adhesion molecule[J].J Mol Histol,2004,35(3):255-262.