李三華高惡斌歐 銅張奇亞

(1.中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

噬藻體PaV-LD主要衣殼蛋白、穿孔素和內(nèi)肽酶基因的克隆及表達分析

李三華1,2高惡斌1歐 銅1,2張奇亞1,2

(1.中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

最近闡明了水華藍藻噬藻體PaV-LD (Planktothrix agardhiiVirus isolated from Lake Donghu)的全基因組序列, 這是一個含有142個ORF的雙鏈DNA噬藻體。在此, 我們對其主要衣殼蛋白基因073R, 內(nèi)肽酶和穿孔素基因123L-124L(PaV-LD基因組中兩個相鄰的ORF)進行了基因克隆與表達分析。將073R克隆后構建原核表達質(zhì)粒pET-32a-073R, 并用IPTG進行誘導表達, 073R融合蛋白經(jīng)純化后, 進行免疫小鼠制備抗體;通過Western blot檢測經(jīng)噬藻體感染宿主細胞后073R的表達時序, 結果顯示在宿主細胞裂解之初, 即PaV-LD感染48h以后073R開始表達, 表明073R是一個晚期基因; 同時073R推導的氨基酸序列與34株噬藻(菌)體及2株藻病毒(感染真核藻的病毒)的主要衣殼蛋白的氨基酸序列進行序列比對, 顯示073R與無尾的藻病毒衣殼蛋白親緣關系更近。PCR擴增內(nèi)肽酶和穿孔素基因123L-124L, 并構建質(zhì)粒pOP123L-124L, 將其轉入模式藻集胞藻PCC6803細胞中, 質(zhì)粒pOP123L-124L與藻集胞藻PCC6803基因組發(fā)生重組, 形成重組藻; 測定了重組藻與野生藻的生長速率, 并繪制生長曲線; 制備超薄切片, 進一步比較和觀察重組藻與野生藻的超微結構的變化。結果顯示重組藻與野生藻存在生長速率與超微形態(tài)的顯著差異。

水華藍藻噬藻體PaV-LD; 主要衣殼蛋白基因(073R); 內(nèi)肽酶基因(123L); 穿孔素基因(124L)

據(jù)報道, 浮游病毒是水生態(tài)環(huán)境中豐度最高的微生物, 它們有豐富的遺傳多樣性和廣泛的地域分布[1—9]。噬藻體是感染藍藻(藍細菌)的病毒, 作為浮游病毒的一個類群, 國內(nèi)外相關領域的學者已對其開展了廣泛研究[10—14]。

尤其是近些年, 關于我國最大的城中淺水型湖泊—武漢東湖中的浮游病毒形態(tài)多樣性、季節(jié)分布及宏基因組分析等已有系列報道[15—17]。經(jīng)多次分離和較長時間培養(yǎng), 我們從東湖水樣中分離獲得了一株能夠感染水華藍藻的無尾噬藻體PaV-LD, 與已知有尾噬藻體目中的長尾科(Siphoviridae)、肌尾科(Myoviridae)和短尾科(Podoviridae) 成員不相同, PaV-LD缺少尾部結構, 呈多面體形態(tài), 這也是無尾噬藻體的第一次報道[18]。從噬藻體PaV-LD全基因組序列中, 可知該噬藻體有142個潛在基因, 其中包括編碼主要衣殼蛋白基因073R、內(nèi)肽酶基因123L和穿孔素基因124L[19]。

通常病毒的主要衣殼蛋白基因是保守的結構蛋白基因, 并且其決定了病毒的形態(tài), 在病毒顆粒的組裝及病毒侵染等過程中起著重要的作用[20—22]。已知內(nèi)肽酶是一種水解細菌(包括藍藻)細胞壁肽聚糖中間部分肽鏈的酶[23,24]; 而穿孔素是一種溶細胞素,能使細胞膜形成小孔, 從而引起細胞的裂解[25]?，F(xiàn)已知在PaV-LD基因組中, 內(nèi)肽酶基因與穿孔素基因是連接在一起的, 形成 123L-124L。為深入認識PaV-LD的結構特征及基因功能, 我們對該噬藻體的073R、123L-124L分別進行了克隆和表達; 通過073R的原核表達及其抗體制備, 測定了噬藻體PaV-LD感染宿主細胞后主要衣殼蛋白基因的表達時序; 并進一步分析了123L-124L表達產(chǎn)物對宿主細胞的生長速率和超微形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

噬藻體、菌株及載體質(zhì)粒 噬藻體PaV-LD是由本實驗室從武漢東湖水樣中分離得到并保存[18]。噬藻體PaV-LD的擴增、提純及基因組核酸的制備、以及感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、BL21(DE3)的制備, 均采用常規(guī)方法[18,19]。pMD18-T克隆載體為TAKARA公司產(chǎn)品; 原核表達載體pET-32a(+)為Novagen公司產(chǎn)品。

酶和生化試劑 KpnⅠ和Hind III 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、T4 DNA聚合酶購自TAKARA公司; DNA Marker、Taq DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司; 蛋白分子量Marker購自Fermentas公司; 醋酸纖維膜購自MILIPORE公司; 堿性磷酸酶標記的抗鼠IgG 二抗購自VECTOR公司。PCR 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自TIAN GEN公司; 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

073R的克隆及原核表達載體的構建 利用引物073R-F/R(引物序列見表 1), 以噬藻體PaV-LD基因組作為模板進行PCR擴增073R, PCR 反應體系: 滅菌雙蒸水17 μL, 10×Taq Buffer (不含 Mg2+) 2.5 μL, 25mmol/L MgCl22.5 μL, dNTP混合物0.5 μL,上下游引物各0.5 μL, Taq 聚合酶 0.5 μL, PaV-LD基因組核酸1 μL。PCR 反應程序: 94℃預變性4min, (94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 90s, 30個循環(huán)), 最后72℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳, 將回收后的目的基因片段與克隆載體pMD18-T連接, 構成重組質(zhì)粒pMD18-T-073R, 再對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行轉化后, 用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒, 并對其進行PCR鑒定和基因全長測序。重組質(zhì)粒pMD18-T-073R中主要衣殼蛋白基因片段經(jīng)KpnⅠ和Hind III 雙酶切, 回收后定向插入經(jīng)同樣雙酶切過的原核表達載體pET-32a(+)中, 構建原核表達質(zhì)粒pET-32a-073R, 再轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒, 經(jīng)雙酶切后, 電泳驗證。

073R原核誘導表達、蛋白純化及抗血清制備將驗證后正確的陽性克隆接種至200 mL Amp+LB培養(yǎng)基中37℃(225rpm/min)培養(yǎng)至A600約為0.6時,加入IPTG(使終濃度為1 mmol/L)誘導, 5h后, 經(jīng)超聲波破碎, 然后利用 Ni-NTA樹脂親和層析純化融合蛋白[26]。

將純化的融合蛋白免疫BALB/C小鼠制備抗體,先取純化蛋白400 μL(約240 μg)與400 μL完全佐劑充分混勻乳化, 腹腔注射; 7d后加強免疫, 共4次,每次間隔7d, 均取純化蛋白400 μL與等體積的不完全佐劑混合乳化, 腹腔注射; 第5次免疫后一周取血, 將血于室溫放置30min或4℃靜置6h, 2000 r/min離心2min, 吸取上層, 分裝后于?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

073R表達時序的Western blotting分析 先取對數(shù)期藻置于細胞六板孔內(nèi), 然后接種PaV-LD病毒懸液(按體積比1∶5), 同時以等體積的BG11培養(yǎng)基取代病毒懸液設為對照, 于25℃光照培養(yǎng)[27]。分別在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h收集感染PaV-LD的藻液, 經(jīng)28000 r/min 離心1h,沉淀用50 μL TE(pH 8.0)重懸, 加50 μL 蛋白上樣緩沖液, 沸水煮5min, 用5%的濃縮膠, 12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳, 轉膜后用含5%脫脂奶粉的TBS (0.02 mol/L Tris-HCl pH 7.4; 154 mmol/L NaCl)孵育1h, 然后用含有0.1%吐溫?20的TBS-T洗3次后, 分別用制備的小鼠血清(PBS 1∶500稀釋)、堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(PBS 1∶1000稀釋)孵育1h, 用TBS-T洗三次后, 采用NBT/BCIP顯色試劑盒進行顯色, 隨時觀察顯色情況, 最后用雙蒸水終止反應[28]。

073R的進化分析 采用軟件DNA Star Lasergene 7.1, 對073R推導的氨基酸序列與來自GeneBank數(shù)據(jù)庫的34株噬藻(菌)體及2株藻病毒的主要衣殼蛋白基因進行序列比對分析, 利用MEGA4軟件作進化分析和構建進化樹。

124L-123L的PCR擴增、重組與轉染質(zhì)粒的構建及模式藻轉化 利用引物124L-F和123L-R(引物序列見表1)以PaV-LD核酸為模板, 擴增124L-123L, PCR反應體系及反應程序參見前面所述(稍有變動: 54℃退火30s, 72℃延伸1min);電泳回收后將上述兩個基因插入到pMD18-T載體中, 構成質(zhì)粒pT-124L-123L。然后將含有壯觀霉素抗性基因(Omega)和啟動子(PpetE)的核酸片段Omega-PpetE組裝到質(zhì)粒pT-124L-123L中, 位于124L上游, 構成重組質(zhì)粒pT-Omega-PpetE-124L-123L。然后利用EcoRⅠ和Hind Ⅲ從重組質(zhì)粒中切下Omega-PpetE- 124L-123L片段, 補平后定點插入到載體質(zhì)粒pKW1188所攜帶的基因slr0168中間, 構成轉化質(zhì)粒pOP124L-123L。

集胞藻PCC6803的轉化: 收集A730為0.8左右的藻細胞, 重懸后與轉染質(zhì)粒pOP124L-123L混合,于光照條件下25℃孵育4h, 然后均勻涂布在覆有硝酸纖維素濾膜的BG11平板上; 光照培養(yǎng)24h后, 將濾膜轉移至含有10 μg/mL 壯觀霉素和50 mmol/L葡萄糖的BG11平板上再培養(yǎng)[29]。轉染質(zhì)粒進入藻后, 與之基因組發(fā)生重組形成重組藻, 從長出的重組藻中, 篩選克隆, 繼續(xù)培養(yǎng)并進一步分析。

重組藻的檢測與分析 (1)PCR擴增。先制備作為模板的野生藻核酸、重組藻核酸及重組質(zhì)粒pOP124L-123L[18,19], 用啟動子PpetE上游引物PpetE-F與124L下游引物124L-R、123L基因下游引物 123L-R和slr0168基因上游引物slr0168-F分別組成的三對檢測引物(引物序列見表1), 通過PCR擴增, PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析。(2)生長速率測定。配制缺銅的BG11液體培養(yǎng)基, 分別用該培養(yǎng)基將野生藻及重組藻初始濃度調(diào)至A730為0.009; 然后在25℃、光照[～35μE/(m2·s)]條件下添加400 nmol/L Cu2+誘導, 另外, 在重組藻培養(yǎng)基中加入10 μg/mL 壯觀霉素, 以抑制野生藻的生長。隨后每天取樣(共培養(yǎng)測定22d), 并通過分光光度計測定其A730值, 指示藻細胞的濃度; 以時間為橫坐標, 以A730值為縱坐標繪制生長曲線。(3)透射電鏡觀察。分別收集培養(yǎng)20d的野生及重組藻細胞, 用2.5%戊二醛固定后按照實驗室常規(guī)方法制備超薄切片[18];利用JEOL 1230型透射電鏡于80kV條件下進行超微觀察。

表1 本研究所用引物及序列(5′—3′)Tab.1 Sequences of the primers used in this study (5′—3′)

2 結果

2.1 獲得073R 的克隆與原核表達質(zhì)粒pET-32a-073R

以PaV-LD基因組為模板, 使用引物073R-F/R通過PCR的方法擴增到特異的073R, 其分子量大小約1 kb。將這條核酸帶切膠回收后, 連接到克隆載體pMD18-T上, 經(jīng)PCR和雙酶切鑒定, 得到陽性克隆。序列測定表明pMD18-T-073R中插入基因的序列與PaV-LD 073R 序列一致。

原核表達質(zhì)粒pET-32a-073R經(jīng)KpnⅠ和Hind III雙酶切驗證。同時對PCR檢測的陽性克隆作進一步測序分析, 結果質(zhì)粒pET-32a-073R中插入的基因序列與073R的序列完全一致, 顯示已成功構建PaV-LD 073R的原核表達質(zhì)粒。

2.2 073R原核表達產(chǎn)物

將誘導pET-32a-073R表達的樣品進行SDSPAGE電泳分析。出現(xiàn)一條較高濃度的誘導表達融合蛋白帶(53 kD), 其中包括載體表達蛋白約17 kD及073R約36 kD, 但在未誘導的樣品中沒有相應的蛋白帶, 經(jīng)離子交換樹脂親和層析柱后,得到純化的53 kD融合蛋白帶(圖1)。提純的融合蛋白用于免疫小鼠,制備鼠抗 PaV-LD 073R血清。

2.3 073R表達時序

利用上述制備的抗血清, 對感染PaV-LD后不同時間制備的藻細胞蛋白進行Western blotting 分析, 檢測感染過程中 PaV-LD 073R 在宿主細胞內(nèi)的表達時序。結果顯示: 在PaV-LD感染48h后, 36 kD的特異條帶開始有微弱表達; 60h至84h, 其表達量顯著增強; 而在96h有所減弱(圖2A)。

圖 1 PaV-LD 073R 原核表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis the prokaryotic expression of PaV-LD 073R gene by SDS-PAGE

另外, 利用顯微鏡觀察感染噬藻體后宿主藻的形態(tài)變化, 可見在PaV-LD感染48h后, 宿主藻的絲狀體斷裂增多, 并且隨著感染時間的延長, 裂解量和裂解程度不斷增加, 至96h絲狀體完全斷裂消失(圖2B)?？梢?73R是在宿主藻細胞發(fā)生裂解時才表達, 這顯示073R是在PaV-LD的感染晚期表達。

2.4 073R序列進化地位

073R全長954 bp,共編碼317個氨基酸, 與其他的34株噬藻(菌)體及2株藻病毒(感染真核藻的病毒)的主要衣殼蛋白氨基酸進行序列比對, 并借助軟件MEGA4構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹。結果顯示噬藻體PaV-LD 073R與有尾噬藻(菌)體 Siphoviridae, Myoviridae, Podoviridae成員的同源性不高,而與無尾藻病毒PBCV-1, EhV86的親緣關系相距較近(圖 3)。

2.5 重組質(zhì)粒pOP124L-123L與重組藻的鑒定

對重組藻與野生藻進行PCR檢測, PCR產(chǎn)物電泳結果如圖4A所示, 條帶大小與預期一致, 除在轉化質(zhì)粒pOP124L-123L中檢測到啟動子PpetE、123L、124L、基因slr0168的N端外, 在重組藻也能檢測到上述基因片段的存在, 而在野生藻中則沒有檢測到,說明片段Omega-PpetE-124L-123L成功經(jīng)同源重組定向插入到集胞藻PCC6803基因組slr0168基因中;另外, 引物PpetE-F、124L-R、123L-R和slr0168-F的位置如圖4B所示, PCR擴增結果也說明片段插入方向正確, 即PpetE啟動子和Omega在基因124L的上游。圖4B顯示了將轉化質(zhì)粒pOP124L-123L轉入野生藻發(fā)生同源重組后的重組藻染色體結構示意圖。

2.6 重組藻的生長速率與超微形態(tài)發(fā)生變化

通過測定, 野生藻從培養(yǎng)第6天開始生長迅速加快, 在第6至第18天期間A730近乎呈直線上升,從0.204上升到1.181, 直至第19天達到最大值1.225, 其后生長速度減緩, 趨于平穩(wěn)。而同時重組藻從第6天開始雖然生長速度也明顯加快, 但在第6至第18天期間A730僅從0.167升到0.698, 直至第21天才達到其最大值0.737, 顯然重組藻較之野生藻生長速度明顯變慢(圖5)。

圖2 Western blot 分析 073R 的表達時序及宿主藻感染PaV-LD后不同時間顯微圖Fig.2 Analysis of the temporal expression of the 073R gene by Western blot and optical microphotographs of host algae cultures after infected by PaV-LD

圖3 073R編碼蛋白 (星號, PaV-LD) 與有尾噬藻(菌)體及無尾藻病毒主要衣殼蛋白(MCP)的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 073R encoding proteins (star, PaV-LD), MCP of tailed cyanophages (or phages) and tailless phycovirus

超微觀察顯示, 野生藻細胞外周呈現(xiàn)電子密度較低的細胞壁是清晰完整的(圖6 Wt); 而重組藻部分細胞壁則很模糊甚至消失, 且細胞原生質(zhì)體局部腫脹, 細胞內(nèi)容物有溢出趨勢(圖6 Re中箭頭所示)。表明重組藻這部分細胞壁已受損或溶解。

3 討論

圖4 PCR鑒定重組藻的電泳圖和重組藻染色體結構示意圖Fig.4 Confirmation of recombinant Synechocystis sp.PCC6803 by PCR and chromosome structure of the recombinant

衣殼是病毒的蛋白質(zhì)外殼, 由于主要衣殼蛋白基因具有結構的相對穩(wěn)定性和序列的保守性, 使人們一直將其作為病毒分類的重要參考[30]。近年來,由于主要衣殼蛋白基因在噬藻體進化關系和多樣性分析方面的靈敏和可靠性, 常被作為標志基因[31,32]。本研究對PaV-LD 073R的進化分析顯示, PaV-LD與已知有尾噬藻(菌)體親緣關系較遠, 而與無尾藻病毒的親緣關系相對較近, 這與電鏡觀察到的無尾形態(tài)學特征相吻合。這表明PaV-LD的進化地位居于原核噬藻體與真核藻病毒之間, 且推測衣殼蛋白基因的進化可能與噬藻體有無尾巴關系密切。

病毒感染宿主后, 要通過基因組的表達完成自身所需生物大分子的合成, 且基因表達按一定時間程序展現(xiàn), 因此了解噬藻體基因的表達時序有助于揭示這類病毒生命周期及與宿主的相互作用[33,34]。在原核表達073R并制備抗體的基礎上, 我們采用Western blotting與顯微觀察相結合的方法, 明確了073R起始表達的時間與宿主藻絲的裂解時間同步,即073R在其宿主藻絲狀體斷裂后才能檢測到有所表達, 顯示073R是PaV-LD的晚期表達基因。

一般認為, 噬菌體要感染細胞就要穿過細胞壁將其核酸注入宿主細胞內(nèi), 這個過程需要具有肽聚糖水解活性的酶及穿孔素等發(fā)揮作用[23], 而大多數(shù)噬菌體至少需要細胞內(nèi)溶素和穿孔素兩種蛋白才能裂解宿主細胞[35], 使子代噬菌體能順利釋放。有證據(jù)表明, 來源于噬菌體P22的細胞溶解素和穿孔素能成功裂解集胞藻PCC6803[36]。由于PaVLD的自然宿主藻尚無現(xiàn)成的遺傳操作系統(tǒng),在此借用模式藍藻集胞藻PCC6803表達PaV-LD 的基因。在獲得含123L-124L重組藻的基礎上, 分析結果顯示, 與野生藻相比,重組藻的生長速率及細胞壁的超微形態(tài)都發(fā)生顯著變化。已有報道介紹, 在實驗室條件下, 當外源基因插入slr0168基因中, 檢測不到其對集胞藻PCC6803有影響[29]。這就表明重組藻細胞壁受損是由于轉入了噬藻體PaV-LD 的123L-124L所致, 且這兩個基因確實發(fā)揮了內(nèi)肽酶與穿孔素的作用, 從而導致重組藻細胞壁損傷或溶解, 并使重組藻細胞生長速率減緩。

圖5 野生藻和重組藻的生長速率Fig.5 Growth curves of wild type and the Recombinant of Synechocystis sp.PCC6803

圖 6 野生藻和重組藻的生長速率及超微形態(tài)Fig.6 Growth curves and ultramicroscopic morphology of Wild type and the Recombinant of Synechocystis sp.PCC6803

水生病毒學研究的對象包括水生動物病毒和藍藻病毒 (噬藻體) 等。近期, 有專家指出, 我國水產(chǎn)動物病毒病原基因組及其功能基因的研究快速發(fā)展,因此為獲得水產(chǎn)動物抗病性狀和候選抗病相關基因奠定了基礎[37]。盡管與水產(chǎn)動物病毒學研究相比,我國噬藻體基因組及功能基因的相關研究尚在起步階段, 但本研究提示: 通過基因組及功能基因研究,不僅有益于人們了解噬藻體的侵染機制, 也將有助于噬藻體重要功能基因的發(fā)現(xiàn), 并就此可進一步研發(fā)噬藻體控藻技術。

致謝:

質(zhì)粒T-Omega-PpetE 和pKW1188由中國科學院水生生物研究所徐旭東研究員實驗室惠贈, 謹致謝忱。

[1] Zhang Q Y.Virioplankton [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2002, 26(6): 691—696 [張奇亞.浮游病毒.水生生物學報, 2002, 26(6): 691—696]

[2] Sullivan M B, Waterbury J B, Chisholm S W.Cyanophages infecting the oceanic cyanobacterium Prochlorococcus [J].Nature, 2003, 424(6952): 1047—1051

[3] Hambly E, Suttle C A.The viriosphere, diversity, and genetic exchange within phage communities [J].Current Opinion in Microbiology, 2005, 8(4): 444—450

[4] Suttle C A.Marine viruses—major players in the global ecosystem [J].Nature Reviews Microbiology, 2007, 5(10): 801—812

[5] Zhang Q Y, Gui J F.A kind of strategic bio-resource not to be neglected—freshwater and marine viruses and their roles in the global ecosystem [J].Bulletin of the Chinese Academy of Sciences, 2009, 24(4): 414—420 [張奇亞, 桂建芳.一類不可忽視的戰(zhàn)略生物資源——淡水與海水中的病毒及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用.中國科學院院刊, 2009, 24(4): 414—420]

[6] Liu X, Zhang Q, Murata K, et al.Structural changes in a marine podovirus associated with viral genome release into Prochlorococcus [J].Nature Structural & Molecular Biology, 2010, 17(7): 830—836

[7] Fischer M G, Suttle C A.A virophage at the origin of large DNA transposons [J].Science, 2011, 332(6026): 231—234

[8] Pope W H, Jacobs-Sera D, Russell D A, et al.Expanding the Diversity of Mycobacteriophages: Insights into Genome Architecture and Evolution [J].PloS One, 2011, 6(1): e16329

[9] Thompson L R, Zeng Q, Kelly L, et al.Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(39): E757—E764

[10] Zhao Y J, Cheng K, Shi Z L, et al.Isolation and identification of the first cyanophage in China [J].Progress in Nature Science, 2002, 12(9): 923—927 [趙以軍, 程凱, 石正麗, 等.我國首株噬藻體(藍藻病毒)的分離與鑒定.自然科學進展, 2002, 12(9): 923—927]

[11] Yoshida M, Yoshida T, Kashima A, et al.Ecological dynamics of the toxic bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa and its cyanophages in freshwater [J].Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(10): 3269—3273

[12] Gao E B, Li S H, Lü B, et al.Analysis of the cyanophage (PaV-LD) infection in host cyanobacteria under different culture conditions [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(3): 420—425 [高惡斌, 李三華, 呂波, 等.水華藍藻噬藻體對不同條件培養(yǎng)的宿主細胞感染性分析.水生生物學報, 2012, 36(3): 420—425]

[13] Sabehi G, Shaulov L, Silver D H, et al.A novel lineage of myoviruses infecting cyanobacteria is widespread in the oceans [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(6): 2037-2042

[14] Liu L, Guo Z L, Huang P, et al.Isolation and identification of a cyanophage in Lake Taihu [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(2): 339—343 [劉露, 郭宗樓, 黃樸, 等.一株太湖水域藍藻噬藻體的分離與鑒定.水生生物學報, 2012, 36(2): 339—343]

[15] Liu Y M, Zhang Q Y, Yuan X P.Studies on abundance and morphological diversity of virioplankton in the Donghu Lake, Wuhan [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2005, 29(1): 1—6 [劉艷鳴, 張奇亞, 袁秀平.武漢東湖浮游病毒的豐度及多樣性.水生生物學報, 2005, 29(1): 1—6]

[16] Liu Y M, Zhang Q Y, Yuan X P, et al.Seasonal variation of virioplankton in a eutrophic shallow lake [J].Hydrobiologia, 2006, 560(1): 323—334

[17] Liu Y M, Yuan X P, Zhang Q Y.Spatial distribution and morphologic diversity of virioplankton in Lake Donghu, China [J].Acta Oecologica-International Journal of Ecology, 2006, 29: 328—334

[18] Gao E B, Yuan X P, Li R H, et al.Isolation of a novel cyanophage infectious to the filamentous cyanobacterium Planktothrix agardhii (Cyanophyceae) from Lake Donghu, China [J].Aquatic Microbial Ecology, 2009, 54(2): 163—170

[19] Gao E B, Gui J F, Zhang Q Y.A Novel Cyanophage with a Cyanobacterial Nonbleaching Protein A Gene in the Genome [J].Journal of Virology, 2012, 86(1): 236—245

[20] Bowman B R, Baker M L, Rixon F J, et al.Structure of the herpesvirus major capsid protein [J].The EMBO Journal, 2003, 22(2): 757—765

[21] Chen R, Neill J D, Noel J S, et al．Inter-and intragenus structural variations in calicivimses and their functional implications [J].Journal of Virology, 2004, 78(12): 6469—6479

[22] Pope W H, Weigele P R, Chang J, et al.Genome Sequence, Structural Proteins, and Capsid Organization of the Cyanophage Syn5: A “Horned” Bacteriophage of Marine Synechococcus [J].Journal of Molecular Biology, 2007, 368(4): 966—981

[23] Moak M, Molineux I J.Peptidoglycan hydrolytic activities associated with bacteriophage virions [J].Molecular Microbiology, 2004, 51(4): 1169—1183

[24] Liu X, Kong S, Shi M, et al.Genomic analysis of freshwater cyanophage Pf-WMP3 infecting cyanobacterium Phormidium foveolarum: the conserved elements for a phage [J].Microbial Ecology, 2008, 56(4): 671—680

[25] Gründling A, Manson M D, Young R.Holins kill without warning [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(16): 9348— 9352

[26] He L B, Ke F, Zhang Q Y.Cloning, expression and localization analysis of a sequence conserved gene (RGV-12L) from Rana grylio virus [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(6): 1166—1171 [何利波, 柯飛, 張奇亞.蛙虹彩病毒一個序列保守基因(RGV-12L)的克隆表達及定位分析.水生生物學報, 2010, 34(6): 1166—1171]

[27] Gao E B, Li S H, Lü B, et al.The analysis of the cyanophage (PaV-LD) infection in host cyanobacteria under different culture conditions [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(3): 420—425 [高惡斌, 李三華, 呂波, 等.水華藍藻噬藻體對不同條件培養(yǎng)的宿主細胞感染性分析.水生生物學報, 2012, 36(3): 420—425]

[28] Chen Z Y, Liu H, Li Z Q, et al.Development and characterization of monoclonal antibodies to spring viraemia of carp virus [J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 123 (3-4): 266—276

[29] Gao H, Tang Q, Xu X D.Construction of copper-induced gene expression platform in Synechocystis sp.6803 [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(2): 240—243 [高宏, 唐蜻,徐旭東.集胞藻 PCC6803 銅離子誘導表達平臺的構建.水生生物學報, 2007, 31(2): 240—243]

[30] Zhan Q Y, Xiao F, Li Z Q, et al.Characterization of an iridovirus from the cultured pig frog Rana grylio with lethal syndrome [J].Diseases of Aquatic Organisms, 2001, 48(1): 27—36

[31] Larsen J B, Larsen A, Bratbak G, et al.Phylogenetic analysis of members of the phycodnaviridae virus family, using amplified fragments of the Major Capsid Protein gene [J].Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(10): 3048—3057

[32] Rowe J M, Fabre M F, Gobena D, et al.Application of the major capsid protein as a marker of the phylogenetic diversity of Emiliania huxleyi viruses [J].FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(2): 373—390

[33] Lindell D, Jaffe J D, Johnson Z I, et al.Photosynthesis genes in marine viruses yield proteins during host infection [J].Nature, 2005, 438(7064): 86—89

[34] Ferrer M D, Quiles-Puchalt N, Harwich M D, et al.RinA controls phage-mediated packaging and transfer of virulence genes in Gram-positive bacteria [J].Nucleic Acids Research, 2011, 39(14): 5866—5878

[35] Wang I N, Smith D L, Young R.Holins: The protein clocks of bacteriophage infections [J].Annual Review Microbiology, 2000, 54(1): 799—825

[36] Liu X, Curtiss R 3rd.Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp.PCC6803 [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(51): 21550—21554

[37] Gui J F, Zhu Z Y, Molecular basis and genetic improvement of economically important traits in aquaculture animals [J].Chinese Science Bulletin, 2012, 57(15): 1751—1760

CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF MAJOR CAPSID PROTEIN GENE, ENDOPEPTIDASE AND HOLIN GENE OF CYANOPHAGE PAV-LD

LI San-Hua1,2, GAO E-Bin1, OU Tong1,2and ZHANG Qi-Ya1,2
(1.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

he 142 open reading frame (ORF) of the genome of cyanophage, PaV-LD (Planktothrix agardhiivirus isolated from the Lake Donghu), was elucidated recently.However, the characteristic of genomic, phylogenetic position, and mechanism of infection remained to be examined on PaV-LD, a novel tailless caynophage.With the relatively stable structure and evolutionarily conserved sequence, the major capsid protein (MCP) gene has been an important reference in the classification of these viruses.Endopeptidase and holin were considered to play an important role in the progress of invasion and release of viruses.The MCP gene (073R), endopeptidase gene (123L), and holin gene (124L) of cyanophage PaV-LD were cloned and the expressions were analysed.PaV-LD073Rwas amplified and cloned, and the prokaryotic expression plasmid pET-32a-073R was constructed.The prokaryotic expression products of PaV-LD073Rwas analyzed by SDS-PAGE after being induced with isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG).The fusion protein was purified via affinity chromatography and was then used to immunize BALB/C mice to prepare the antiserum against PaV-LD 073R.Next the antiserum was used for Western blotting analysis and the temporal expression pattern of PaV-LD073Rwas characterized during PaV-LD infection at different times.The results of western blotting indicated that the MCP was initially expressed at 48h post-infection (p.i.) and developed into particularly enhanced from 60h p.i.to 84h p.i.The data also demonstrated that073Rwas a late expression gene of the tailless cyanophage genome.To further investigate the phylogenetic position of PaV-LD, a phylogenetic tree was constructed using the Neighbor-Joining method with 34 tailed cyanophages and 2 phycoviruses (viruses that infect eukaryotic algae).The analysis of the phylogenetic tree revealed that the amino acid sequences in PaV-LD 073R grouped more closely with tailless phycoviruses instead of the tailed cyanophages, indicating that PaV-LD had the morphological characteristics of the tailless phycoviruses.PaV-LD endopeptidase gene and holin gene (two adjacent ORFs in the genome of PaV-LD,123L-124L) were amplified using polymerase chain reaction (PCR) and the plasmid contained a spectinomycin resistance gene, then the promoter genes pPetE and 123L-124L were constructed and integrated into the genome of Synechocystis sp.PCC6803 via homologous recombination.The growth curves of the recombinant and the wild type of Synechocystis sp.PCC 6803 were drawn, and the growth rate of the recombinant was found to be significantly slower than the wild type.Ultrastructural morphology observation with transmission electron microscopy showed that the cell wall of recombinant was damaged partly or fully, causing protoplast swelling and the leakage of cell contents.Results suggested that PaV-LD 123L-124L could express the functional proteins that played a role in dissolving cell wall and slowing down cell growth in the recombinant Synechocystis sp.PCC 6803.

Cyanophage infecting bloom-forming cyanobacteria PaV-LD; Major capsid protein gene (073R); Endopeptidase gene (123L); Holin gene (124L)

X179

A

1000-3207(2013)02-0252-09

10.7541/2013.12

2012-03-27;

2012-10-09

中國科學院先導專項項目(KSCX2-EW-Z-3); 國家自然科學基金項目(31072239); 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室基金(2011FBZ12)資助

李三華(1987—), 男, 山西人; 碩士研究生; 從事水生病毒及分子生物學研究。E-mail: lisanhua1987@163.com

張奇亞, Tel: +86-027-68780792; E-mail: zhangqy@ihb.ac.cn