楊移斌 夏永濤 鄭衛(wèi)東 胡 鯤 楊先樂(lè)

(1. 上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù), 上海 201306; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院, 北京 100039;3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223)

西伯利亞鱘隸屬于硬骨魚(yú)綱, 輔鰭亞綱, 硬鱗總目,鱘形目(Acipenseriformes), 全世界現(xiàn)存 26種鱘[1], 我國(guó)的鱘類(lèi)有2科3屬8種, 分布在長(zhǎng)江水系的有中華鱘(Acipenser sinensis)、白鱘(Psephurus gladius)和達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus); 黑龍江水系的有施氏鱘(Acipenser schrenckii)和達(dá)氏鰉(Huso dauricus); 新疆地區(qū)有裸腹鱘(Acipenser nudiventris)、小體鱘(Acipenser ruthenus)和西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[2]。鱘魚(yú)是地球上最古老的魚(yú)種之一,素有“活化石”之稱(chēng), 是我國(guó)的名特優(yōu)珍品, 肉味鮮美、骨軟、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 鱘魚(yú)肉和卵的蛋白含量高達(dá)18%和29%。另外特別值得一提的是具有“黑色黃金”之稱(chēng)的鱘魚(yú)子醬, 是由鱘魚(yú)卵加工而成, 更是馳名中外的高檔食品, 在國(guó)際市場(chǎng)十分走俏。我國(guó)第一個(gè)鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)1992年在大連瓦房店成立, 開(kāi)啟了我國(guó)鱘魚(yú)的商業(yè)化養(yǎng)殖, 西伯利亞鱘養(yǎng)殖規(guī)模居中國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量的第 1位[2], 但隨著養(yǎng)殖品種及規(guī)模的不斷增加, 病害正在逐步增加, 已經(jīng)嚴(yán)重影響了鱘魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。如革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas carvia)和類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesimonas shigelloides)[3—6]感染鱘魚(yú)致病的報(bào)道, 還有革蘭氏陽(yáng)性菌鏈球菌感染鱘魚(yú)使其致病[7,8]的報(bào)道。2012年6月我國(guó)浙江省衢州市鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的鱘魚(yú)出現(xiàn)生殖孔紅腫,有膿狀物流出, 病魚(yú)解剖觀察發(fā)現(xiàn)性腺?gòu)纳晨滋庨_(kāi)始布有小斑點(diǎn), 呈紫紅色, 性腺呈糜爛狀并最后與體壁脫離, 心臟出現(xiàn)嚷腫, 肝臟顏色呈灰色, 體壁未充血, 也未出血, 脾臟嚴(yán)重充血導(dǎo)致呈紫黑色, 腸內(nèi)無(wú)食物, 腎臟未充血, 但是發(fā)生病變。發(fā)病鱘魚(yú)集中在西伯利亞鱘、史氏鱘和雜交鱘。本研究從發(fā)病鱘魚(yú)中分離出一株高致病性的致病菌, 通過(guò)常規(guī)生理生化鑒、16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對(duì)該菌進(jìn)行了分類(lèi)鑒定, 并測(cè)定了其一些生物學(xué)特性和對(duì)藥物敏感性, 旨在為鱘魚(yú)魯氏耶爾森氏菌病的有效防控提供理論參考依據(jù), 且為鱘魚(yú)健康養(yǎng)殖及病害防治增加新的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú) 試驗(yàn)用魚(yú)為易感染發(fā)病的西伯利亞鱘,病魚(yú)采自浙江衢州鱘魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng), 人工感染用健康西伯利亞鱘取自此養(yǎng)殖基地。

主要試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、5%綿羊血平板和水解酪蛋白瓊脂(MH)按常規(guī)方法自制; 腦心浸出液瓊脂購(gòu)自北京陸橋生物制品有限公司; 細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA試劑盒, TaqDNA聚合酶均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司; 藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

流行病學(xué)調(diào)查及發(fā)病癥狀觀察 調(diào)查養(yǎng)殖場(chǎng)鱘魚(yú)發(fā)病情況及死亡率, 了解發(fā)病種類(lèi)及規(guī)格以及掌握相應(yīng)水域環(huán)境狀況。查看魚(yú)體外表, 解剖觀察內(nèi)臟器官是否有明顯的病變, 從而確定疾病的基本癥狀, 并取病樣組織進(jìn)行病原菌分離與純化。

病原菌分離純化 選取具有典型癥狀的西伯利亞鱘, 用75%的酒精在病魚(yú)體表消毒后, 解剖開(kāi)取其性腺、肝、腎等病灶組織少許, 無(wú)菌條件下劃線接種于腦心浸出液瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上, 置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—48h, 挑起在平板上較多的、形態(tài)顏色一致的菌落,選擇單個(gè)菌落進(jìn)一步劃線培養(yǎng)純化, 最后轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上, 于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人工感染試驗(yàn) 選取健康的西伯利亞鱘, 設(shè) 1個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。試驗(yàn)組為6尾, 對(duì)照組為4尾, 水溫都控制在 20—22℃, 模擬自然發(fā)病環(huán)境狀況。細(xì)菌HD0923在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上28℃培養(yǎng)24h, 用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔, 用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為 4×107CFU/mL, 分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組鱘魚(yú)進(jìn)行胸鰭基部注射, 每尾注射0.2 mL菌液。對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水, 試驗(yàn)水缸連續(xù)充氧, 不投喂。觀察魚(yú)的發(fā)病及死亡情況, 并對(duì)瀕死魚(yú)及時(shí)剖檢和對(duì)致病菌的再次分離與純化。

病原菌形態(tài)與理化特性檢測(cè) 將菌株 HD0923接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板, 28℃培養(yǎng)24h后觀察菌落的大小、形態(tài)及顏色, 同時(shí)革蘭氏染色, 采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌其形態(tài), 其他各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

菌株 HD0923的 16S rDNA基因序列測(cè)定與分析(1)細(xì)菌 16S rDNA模板的制備: 將細(xì)菌接種于腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)中, 28℃震蕩培養(yǎng)18h, 12000 r/min離心收集菌體, 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌總DNA, 作為PCR的模板DNA。

(2)16S rDNA基因系列的擴(kuò)增與測(cè)序: 用于 16S rDNA的 PCR反應(yīng)的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

正向引物為 27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′(對(duì)應(yīng)于 E. coli的 16S rRNA 基因的第 8—27 bp 位置)。

反向引物 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(對(duì)應(yīng)于E. coli的16S rRNA基因的第1492—1510 bp位置)。

PCR反應(yīng)條件為: 95℃變性3min, 94℃平衡35s, 55℃退火 35s, 72℃延伸 1min, 此階段 35個(gè)循環(huán), 72℃溫育10min。經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以證明 PCR擴(kuò)增得到的片段是否是目的片段后,將PCR的最終產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。

(3)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù): 將菌株HD0923的16S rDNA序列用運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比對(duì), 從中選取17株與該株菌基因序列最相似的菌株和5種水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌, 采用 Clustal w軟件進(jìn)行多序列匹配分析,用MEGA5.1軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 通過(guò)1000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

藥物敏感試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用 K-B法, 將菌株HD0923接種于腦心浸出液(BHI)液體培養(yǎng)基, 置于 28℃搖床培養(yǎng) 18h后分別涂布水解酪蛋白瓊脂(MH)平板。選擇 17種藥敏紙片均勻貼于平板, 每個(gè)平板貼 5片, 置28℃下培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)《現(xiàn)代診斷學(xué)手冊(cè)》[10]標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 自然發(fā)病流行情況及臨床表現(xiàn)

2012年6月中旬至8月浙江衢州衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開(kāi)發(fā)有限公司的花園基地接連不斷出現(xiàn) 3齡以上的以西伯利亞鱘、史氏鱘、雜交鱘為主的死亡現(xiàn)象, 本公司其他幾個(gè)相鄰鱘魚(yú)養(yǎng)殖基地相繼發(fā)生, 死亡率高達(dá)80%。發(fā)病水溫在 20—22℃。發(fā)病初期病魚(yú)緩慢游動(dòng), 精神不振, 表現(xiàn)為鄰近水面離群獨(dú)游或者靜止不動(dòng), 嚴(yán)重者身體失去平衡、貼壁側(cè)游或尾巴向上、頭向下漂浮在水中,食欲漸減至不食, 生殖孔出現(xiàn)紅腫潰爛。檢查鱘魚(yú)性腺成熟度時(shí), 能發(fā)現(xiàn)鱘魚(yú)生殖孔出現(xiàn)輕微紅點(diǎn), 即開(kāi)始發(fā)病。發(fā)病鱘魚(yú)的主要癥狀初期體表表現(xiàn)為有絕大多數(shù)發(fā)病鱘魚(yú)下頜有潰爛產(chǎn)生, 尤以生殖孔部位出血潰爛明顯。解剖觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官存在不同程度的損傷, 體壁未充血,肝臟呈灰色且腫大、易碎, 脾臟出血嚴(yán)重導(dǎo)致呈紫黑色,腎臟呈紫紅色, 心臟呈嚷腫狀。潰爛部位集中在性腺, 潰爛前表面形成紫紅色出血點(diǎn), 深度大約 3 cm左右, 有的布滿整個(gè)性腺, 有的只在靠近生殖孔一端發(fā)現(xiàn), 有的從靠近生殖孔一端開(kāi)始潰爛, 有的是整個(gè)性腺一起潰爛,性腺潰爛成膿血水, 從生殖孔流出體外, 性腺?gòu)捏w壁脫落, 最終發(fā)病鱘魚(yú)死亡。

2.2 病原菌分離

從 5尾具有典型發(fā)病癥狀但未死亡的病魚(yú)肝臟、腎臟和性腺組織取樣于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和腦心浸出液瓊脂平板上劃線, 置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h后獲得一株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌, 編號(hào)為 HD0923。該菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,形成橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊, 整個(gè)菌落呈凸起狀,直徑1 mm的透明的白色菌落。從人工感染的病魚(yú)取同樣的組織劃線分離, 得到的菌株菌落形態(tài)、大小、顏色與此一致。

2.3 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)組西伯利亞鱘在接種感染后 24h, 表現(xiàn)為無(wú)力游動(dòng), 呼吸緩慢, 生殖孔紅腫, 有橙色膿狀液體從生殖孔流出, 發(fā)病鱘占試驗(yàn)組鱘總數(shù) 66.7%, 而對(duì)照組未見(jiàn)異常。對(duì)發(fā)病的西伯利亞鱘進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)生殖孔紅腫潰爛,解剖可見(jiàn)肝臟呈灰色, 脾臟嚴(yán)重出血呈紫黑色, 腎臟呈紫紅色, 心臟呈嚷腫狀, 性腺表面有紫紅色出血點(diǎn), 性腺出現(xiàn)潰爛, 從靠近生殖孔處開(kāi)始潰爛, 性腺潰爛成膿血水, 從生殖孔流出體外, 與自然發(fā)病鱘魚(yú)和病變相似。并從感染死亡魚(yú)肝臟、腎臟和性腺組織分離到與菌株HD0923形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析一致的細(xì)菌, 表明菌株HD0923是鱘魚(yú)此病的病原菌。

2.4 形態(tài)特征

分離菌株 HD0923為革蘭氏陰性短狀桿菌, 無(wú)芽孢和莢膜, 在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌落呈灰白色, 橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊的白色菌落, 整個(gè)菌落呈凸起狀, 直徑 0.7—1 mm; 在腦心浸出液瓊脂平板上形成橢圓形, 表面光滑, 邊緣整齊, 整個(gè)菌落呈凸起狀, 直徑1—1.3 mm的透明的白色菌落; 在5%綿羊血平板上不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.5 生理生化特征

分離菌株 HD0923適宜生長(zhǎng)溫度范圍為 18—36℃,最適生長(zhǎng)溫度為 24—31℃, 其中在 28—29℃有一個(gè)生長(zhǎng)的明顯加快階段。其適宜生長(zhǎng)的 pH范圍為 4—10, 最適pH為5.0—8.0, 其他的生理生化特征(表1)。

2.6 16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增分離株HD0923獲得的16S rDNA基因片段約1500 bp (圖1)。測(cè)序獲得長(zhǎng)1416 bp的片段, 獲得的序列與GenBank中已收錄的相關(guān)性較高的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析結(jié)果表明, 從發(fā)病西伯利亞鱘分離的細(xì)菌16S rDNA基因序列與魯氏耶爾森氏(Y. ruckeri)同源性最高, 為 100%, 選取了檢索的部分耶爾森氏菌屬細(xì)菌和水產(chǎn)上常見(jiàn)病原菌的 16S rDNA基因序列用 Neighbor-Joining方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上HD0923株與魯氏耶爾森氏菌(Y. ruckeri)聚為一個(gè)分支, 同源性達(dá)到 100%。根據(jù)分離菌的形態(tài)特征及理化特性, 結(jié)合16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果, 判定該菌為魯氏耶爾森氏菌(Y. ruckeri)。

表1 HD0923菌株的生理生化特征Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of HD0923

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離株 HD0923對(duì) 17種藥物的敏感性結(jié)果(表 2)表明, 分離菌株HD0923對(duì)強(qiáng)力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、先鋒霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特靈、慶大霉素 10種藥物高度敏感, 對(duì)青霉素和克林霉素不敏感, 對(duì)其他幾種藥物中度敏感。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于鱘魚(yú)細(xì)菌性病害的報(bào)道呈不斷增加的趨勢(shì), 如楊治國(guó)、儲(chǔ)衛(wèi)華、曹海鵬等先后對(duì)西伯利亞鱘相關(guān)疾病進(jìn)行了報(bào)道, 主要病原為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)以及類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[3—6], 潘厚軍等對(duì)西伯利亞鱘感染停乳鏈球菌[8]的報(bào)道, 使得鱘魚(yú)健康養(yǎng)殖受到巨大的威脅, 西伯利亞鱘細(xì)菌性疾病成為了其養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸之一。

圖1 分離菌株HD0923的16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of 16SrDNA PCR amplification of HD0923 strain

圖2 根據(jù)16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog

本研究從發(fā)病西伯利亞鱘的肝臟、腎臟和性腺均分離到一株革蘭氏陰性細(xì)菌 HD0923, 發(fā)現(xiàn)其對(duì)鱘具有明顯的致病性, 經(jīng)人工感染后出現(xiàn)生殖孔紅腫潰爛, 解剖發(fā)現(xiàn)各器官不同程度損傷, 性腺發(fā)生潰爛; 與自然發(fā)病的癥狀一致, 而在人工感染發(fā)病鱘魚(yú)肝臟、腎臟和性腺也分離到與HD0923形態(tài)特征、理化特性一致的菌株, 表明菌株 HD0923是西伯利亞鱘的該病的致病菌。菌株HD0923經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)該菌株為魯氏耶爾森氏菌(Y.ruckeri)。

目前的細(xì)菌分類(lèi)鑒定法, 主要包括表型鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定兩大類(lèi)[11]。細(xì)菌的常規(guī)鑒定法—形態(tài)法是經(jīng)典、常用的分類(lèi)鑒定方法, 其結(jié)果準(zhǔn)確, 但鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)。依據(jù)細(xì)菌生理生化特性進(jìn)行分類(lèi)的方法, 通常由于生化的不完全性, 反應(yīng)過(guò)度, 結(jié)果判斷誤差等造成鑒定不準(zhǔn), 以及從不同的水域和寄主體內(nèi)分離到的菌株由于水域、氣候、水質(zhì)等方面的不同而產(chǎn)生細(xì)小的生化特性差異,一般情況下只能準(zhǔn)確鑒定到屬。在本研究中因阿拉伯糖等生化特性方面與標(biāo)準(zhǔn)菌株不同, 也與汪開(kāi)毓等在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)分離到的魯氏耶爾森氏菌不同[12], 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 特別是分子生物學(xué)取得突破性進(jìn)展, 細(xì)菌的鑒定也進(jìn)入到分子生物學(xué)水平, 多種基因型分類(lèi)方法也應(yīng)運(yùn)而生了, 如 DNA雜交、rDNA指紋圖、質(zhì)粒圖譜、(G+C) mol%、16S rDNA序列分析及Gyrb序列分析等。16S rDNA序列分析成為細(xì)菌種屬鑒定和分類(lèi)的常用標(biāo)準(zhǔn)方法, 并于廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病病原菌的種屬鑒定[13,14]。主要步驟是把測(cè)出來(lái)的細(xì)菌16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì), 從而構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定細(xì)菌種類(lèi)。本研究通過(guò) 16S rDNA序列同源性分析,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離到的菌株HD0923為與魯氏耶爾森氏菌的同源性達(dá)到 100%, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果, 從而確定該致病菌HD0923為魯氏耶爾森氏菌。

魯氏耶爾森氏菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、耶爾森氏菌屬(Yersinia), 是冷水性鮭科魚(yú)類(lèi)的常見(jiàn)紅嘴病病原菌[15], 現(xiàn)在幾乎對(duì)養(yǎng)殖的鮭鱒魚(yú)類(lèi)品種都具感染性, 并且該菌亦被發(fā)現(xiàn)能引起溫水性鯉科鰱、鳙魚(yú)的發(fā)病和死亡[16], 危害較大。該菌自1952首次從美國(guó)暴發(fā)的紅嘴病中分離到后[15], 現(xiàn)流行于澳大利亞、南非和西歐等地,宿主范圍和地域都進(jìn)一步擴(kuò)大, 表明該菌具有廣泛的致病性。但是在人工養(yǎng)殖的鱘魚(yú)體內(nèi)引起性出血潰爛在國(guó)內(nèi)尚屬首次, 筆者推測(cè)可能原因是鱘魚(yú)亦屬冷水性魚(yú)類(lèi),在生活習(xí)性上與鮭科魚(yú)類(lèi)具有一定的相關(guān)性。而且此次西伯利亞鱘自然感染魯氏耶爾森氏菌發(fā)病的水溫在 20—22℃左右, 出現(xiàn)的臨床癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道的感染魯氏耶爾森氏菌后發(fā)病魚(yú)的臨床癥狀相似[17,18], 發(fā)病水溫相近,特別與汪開(kāi)毓等報(bào)道斑點(diǎn)叉尾感染魯氏耶爾森氏菌導(dǎo)致肛門(mén)紅腫, 下頜出血, 脾臟嚴(yán)重出血呈紫黑色, 性腺有不同程度的出血等癥狀相似[12]。不同的是本次發(fā)病鱘魚(yú)的性腺發(fā)生嚴(yán)重潰爛, 死亡率高, 鱘充血體內(nèi)各實(shí)質(zhì)器官充血不如其他報(bào)道魚(yú)類(lèi)明顯。另?yè)?jù)文獻(xiàn)資料表明當(dāng)水溫低于 20℃時(shí), 魯氏耶爾森氏菌分泌的致病性外毒素溶血素的能力增強(qiáng)使細(xì)菌的毒力增大, 但在最適生長(zhǎng)溫度28℃時(shí), 魯氏耶爾森氏菌分泌的致病性毒素溶血素的活性并不強(qiáng)[19]。在本研究中在5%綿羊血平板上生長(zhǎng)的魯氏耶爾森氏菌未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象, 與汪開(kāi)毓等結(jié)果相同[12]。據(jù)本研究觀察發(fā)現(xiàn)此次發(fā)布鱘魚(yú)性腺產(chǎn)生嚴(yán)重潰爛, 這與鮭鱒魚(yú)類(lèi)、溫水性鰱鳙以及斑點(diǎn)叉尾感染魯氏耶爾森氏菌的癥狀明顯不同, 可能是由于不同水域條件、發(fā)病物種以及不同氣候環(huán)境導(dǎo)致的, 需進(jìn)一步探究。

表2 HD0923藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic sensitivity test of strain HD0923

本研究結(jié)果表明, 魯氏耶爾森氏菌 HD0923對(duì)強(qiáng)力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、先鋒霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特靈、慶大霉素10種藥物高度敏感, 但對(duì)青霉素和克林霉素不敏感, 表現(xiàn)很強(qiáng)的耐藥性。這與汪開(kāi)毓等從感染魯氏耶爾森氏菌的斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)分離到的魯氏耶爾森氏菌藥敏特性有所不同[12], 與其結(jié)果對(duì)比氯霉素的敏感性下降, 產(chǎn)生藥敏特性差異的可能原因是不同區(qū)域、不同水域環(huán)境中的菌株接觸到不同的藥物環(huán)境作用影響而產(chǎn)生耐藥性變異的差異[20]。此外, 本研究選取的藥物并非均可用于生產(chǎn), 在本研究中僅用于分析魯氏耶爾森氏菌 HD0923的藥敏特性,魯氏耶爾森氏菌HD0923的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在生產(chǎn)中治療感染魯氏耶爾森氏菌的病魚(yú)時(shí)可選那些高度敏藥物進(jìn)行防治, 氟苯尼考來(lái)是個(gè)不錯(cuò)的選擇。但是魯氏耶爾森氏菌 HD0923對(duì)一些水產(chǎn)常用抗生素已產(chǎn)生極強(qiáng)的耐藥性, 這是個(gè)危險(xiǎn)的信號(hào), 暗示我們鱘魚(yú)養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過(guò)程中要慎重選用漁用抗生素, 盡量防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。雖然現(xiàn)在的化學(xué)藥物是防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治的主要手段, 但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥品特別是抗生素等將導(dǎo)致病原產(chǎn)生耐藥性, 結(jié)果是疾病防治失敗, 同時(shí)也很有可能導(dǎo)致水產(chǎn)品中的藥物殘留問(wèn)題, 影響水產(chǎn)品質(zhì)量和安全等。自從魯氏耶爾森氏菌的福爾馬林滅活疫苗首次在鮭科魚(yú)類(lèi)疾病防治中使用以來(lái)[21], 注射疫苗法都是預(yù)防魚(yú)類(lèi)魯氏耶爾森氏菌病發(fā)生的重要方法[22]。但由于魯氏耶爾森氏菌是在鱘魚(yú)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道不多, 相關(guān)的研究亦不多, 注射疫苗防治法研究的開(kāi)展更少, 因此在探索疫苗免疫防治的同時(shí)不妨進(jìn)行生態(tài)防治, 利用微生物制劑無(wú)殘留以及對(duì)水質(zhì)影響不大的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行防治, 降低養(yǎng)殖生產(chǎn)的損失。