夏西超楊 洪寧黔冀呂 黎呂艷杰

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 南陽 473061)

KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦物質(zhì)儲(chǔ)備相關(guān)酶類基因表達(dá)的影響

夏西超1,2楊 洪1寧黔冀1呂 黎1呂艷杰1

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 南陽 473061)

甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育總是與蛻皮聯(lián)系在一起的[1]。為了完成蛻皮, 順利實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng), 甲殼動(dòng)物在蛻皮間期進(jìn)行快速大量取食, 臨近蛻皮前取食逐漸減少, 直至蛻皮時(shí)停止, 待蛻皮后動(dòng)物具備了堅(jiān)硬外殼, 又開始緩慢取食[2?3]?；趯?duì)甲殼動(dòng)物幼體物質(zhì)儲(chǔ)備的研究, Anger和Dawirs提出不可恢復(fù)點(diǎn)(Point of no return, PNR)和飽和儲(chǔ)存點(diǎn)(Point of reserve saturation, PRS)兩個(gè)學(xué)說, 闡述了物質(zhì)儲(chǔ)備與蛻皮之間的關(guān)系: PNR指在蛻皮過程中, 若物質(zhì)儲(chǔ)備未到達(dá)極限點(diǎn), 即使再補(bǔ)充餌料也無法使動(dòng)物順利發(fā)育進(jìn)入下一個(gè)蛻皮周期; PRS指蛻皮前動(dòng)物物質(zhì)儲(chǔ)備如果充足, 此時(shí)有無餌料供應(yīng), 動(dòng)物都可以順利進(jìn)入蛻皮周期, 完成正常發(fā)育過程[4]。由此可見, 足夠的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備是啟動(dòng)甲殼動(dòng)物蛻皮的前提, 并為順利度過蛻皮后脆弱階段提供能量。該過程涉及多種酶的參與, 如肝胰腺中的胰蛋白酶、組織蛋白酶L、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等[5]。

咪唑類物質(zhì)KK-42通常被視為是保幼激素的拮抗物,對(duì)昆蟲的研究表明, 該類物質(zhì)作用機(jī)理復(fù)雜, 其中包括影響幾丁質(zhì)酶的表達(dá)、干擾(或抑制)保幼激素的合成來改變昆蟲的生長(zhǎng)速率[6—8]。我們前期研究首次發(fā)現(xiàn), KK-42能夠促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)[9]。鑒于有機(jī)物儲(chǔ)備在凡納濱對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)中的作用, 我們選取了幾種影響有機(jī)物儲(chǔ)備的重要酶類, 首次從轉(zhuǎn)錄水平定量分析了KK-42對(duì)這些酶表達(dá)的影響, 為闡明KK-42作用的分子機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1.1 南美白對(duì)蝦的處理

凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖于鞏義市黃河生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)園。在面積2664 m2(4畝)、水深1.5 m的池塘中, 架設(shè)2個(gè)面積60 m2、深1.5 m的網(wǎng)箱, 從池塘中采集健康幼蝦(體長(zhǎng)3.5—5.0 cm)800頭, 隨機(jī)分成2組, 其中一組用1.95×10?4mol/L的KK-42(煙臺(tái)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系提供, 純度≥95%)溶液浸泡處理1min[7], 取出, 空氣中靜置數(shù)秒, 立刻投入到網(wǎng)箱中, 按正常方式養(yǎng)殖; 對(duì)照組用不含KK-42的溶液處理, 方法同上。KK-42處理后0、1、2、3、4、5、6、7、8d, 將動(dòng)物冷凍麻醉, 解剖出肝胰腺, 液氮速凍,?80℃保存。

1.2 mRNA水平的定量測(cè)定

RNA提取用RNAiso Plus (TaKaRa)提取凡納濱對(duì)蝦肝胰腺總RNA, 總RNA的完整性和純度用凝膠電泳檢測(cè), RNA的濃度根據(jù)A260進(jìn)行定量。

cDNA第一鏈的合成按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)操作說明合成cDNA第一鏈。10 μL反應(yīng)體系: 5×PrimScriptTMBuffer 2 μL, PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL, Oligo dT Primer (50 mol/L) 0.5 μL, Random 6 mers (100 mol/L) 0.5 μL, 總RNA 100 ng。反應(yīng)條件: 37℃, 15min, 85℃, 5s。

PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因β-actin保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物, 引物由上海生工公司合成(表1)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μL體系中包括: SYRB Premix ExTaqTM(TaKaRa) 10 μL, PCR上下游引物(10 mol/L)各0.4 μL, cDNA模板2 μL, ROX Reference Dye (TaKaRa) 0.4 μL, dH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30s, 1 cycle; 95℃ 5s, 60℃ 34s, 40 cycles。測(cè)定相關(guān)酶基因表達(dá)的樣本數(shù)為9頭/組/時(shí)間點(diǎn), 重復(fù)3次。結(jié)果采用2?ΔΔct法進(jìn)行分析, 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用unpairedt-test統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 KK-42對(duì)胰蛋白酶、血藍(lán)蛋白和組織蛋白酶L表達(dá)的誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)觀察期間, 對(duì)照組肝胰腺中胰蛋白酶 mRNA水平相對(duì)穩(wěn)定(圖1)。KK-42處理后1—6天, 胰蛋白酶mRNA水平升高42.6%以上, 尤其在第3至第6天達(dá)79.9%以上(P<0.01)(圖1), 第7至第8天雖有升高, 但與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在對(duì)照組中, 肝胰腺組織蛋白酶L的基因表達(dá)水平相比血藍(lán)蛋白呈明顯的波動(dòng)性變化(圖2、圖3)。KK-42處理能顯著誘導(dǎo)血藍(lán)蛋白和組織蛋白酶L 的轉(zhuǎn)錄, 前者mRNA水平在第1、第2、第3、第4、第6和第7天分別提高96.3%、106.2%、382.6%、116.2%、150.0%和202.1%(P<0.01)(圖2); 后者在第4和第7 天升高幅度相對(duì)較小, 但也在51.9%以上(圖3)。

2.2 KK-42對(duì)肝胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶表達(dá)的抑制

在對(duì)照組中, 肝胰腺α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶mRNA水平相對(duì)穩(wěn)定(圖4、圖5)。KK-42處理可顯著抑制上述兩種酶mRNA的轉(zhuǎn)錄, 其中, α-淀粉酶在第1至第7天降幅51.9%以上, 第8天與對(duì)照組無顯著性差異(圖4); 在實(shí)驗(yàn)觀察期間, α-葡萄糖苷酶的下調(diào)幅度均在57.2%以上(圖5)。

圖1 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)Fig.1 The time-course induction of KK-42 on hepatopancreas trypsin mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖2 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織蛋白酶L基因表達(dá)的誘導(dǎo)Fig.2 The time-course inducation of KK-42 on hepatopancreas cathep sin L mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖3 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺血藍(lán)蛋白基因表達(dá)的誘導(dǎo)Fig.3 The inducation of KK-42 on hepatopancreas hemocyanin mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖4 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺α-淀粉酶基因表達(dá)的抑制Fig.4 The time-course inhibition of KK-42 on hepatopancreas α-amylase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

2.3 KK-42對(duì)肝胰腺幾丁質(zhì)酶和N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶表達(dá)的上調(diào)

在對(duì)照組中, 幾丁質(zhì)酶mRNA水平呈明顯波動(dòng)性變化(圖6), 而N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶基因表達(dá)水平與第0天比變化不大(圖7)。KK-42處理后, 幾丁質(zhì)酶mRNA水平顯著升高, 尤其在第1至第4天分別達(dá)到317.1%、627.0%、201.3%和474.3%(P<0.01)(圖6); N-乙?；?β-D-葡萄糖苷酶mRNA含量在第1至第6天升高135.5%以上(P<0.01), 之后與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的變化(圖7)。

圖5 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺α-葡萄糖苷酶基因表達(dá)的下調(diào)Fig.5 The time-course down-regulation of KK-42 on hepatopancreas α-glucosidase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖6 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的上調(diào)Fig.6 The up-regulation of KK-42 on hepatopancreas chitinase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

圖7 KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺N-乙酰基-β-D-葡萄糖苷酶基因表達(dá)的上調(diào)Fig.7 The up-regulation of KK-42 on hepatopancreas N-acetyl-β-D-glucosaminidase mRNA expression in Litopenaeus vannamei

3 討論

充足的物質(zhì)儲(chǔ)備對(duì)啟動(dòng)甲殼動(dòng)物蛻皮、促進(jìn)其生長(zhǎng)具有重要作用。我們推測(cè), KK-42的作用機(jī)制可能包含在凡納濱對(duì)蝦幼蝦物質(zhì)儲(chǔ)備的某些環(huán)節(jié)中, 據(jù)此本論文首先在轉(zhuǎn)錄水平上分析了與動(dòng)物蛻皮、生長(zhǎng)密切相關(guān)的幾種酶的表達(dá)變化。

在8d的實(shí)驗(yàn)觀察期間, 對(duì)照組胰蛋白酶的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定(圖1), 表明凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)過程需要不斷從食物中攝取蛋白, 進(jìn)行分解、吸收和利用。對(duì)蝦餌料組分中,粗蛋白的比例高達(dá)50%以上, 肝胰腺胰蛋白酶在食物消化過程中起重要作用[10], 與其較高的表達(dá)水平相一致。KK-42處理之后, 胰蛋白酶表達(dá)量顯著升高(圖1), 這應(yīng)該有助于機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化和儲(chǔ)備。研究發(fā)現(xiàn), 在無食物可取的情況下, 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胰蛋白酶活性會(huì)下降40%—60%, mRNA水平降低30%, 動(dòng)物蛻皮被推遲[11];蛻皮前胰蛋白酶mRNA水平和酶活性都顯著提高, 加速物質(zhì)儲(chǔ)備并達(dá)到飽和點(diǎn), 為蛻皮奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[11,12]; 處理后第7至第8天, KK-42對(duì)胰蛋白酶的誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸減弱, 可能是機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的儲(chǔ)備已達(dá)到飽和點(diǎn)。與對(duì)照組相比, 處理組肝胰腺組織蛋白酶L mRNA水平明顯升高(圖2), 這可能提高了動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力, 有助于動(dòng)物的生長(zhǎng)和蛻皮。據(jù)報(bào)道, 蛻皮前凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織蛋白酶L表達(dá)水平明顯升高[13—15]; Chan,et al.采用RNAi技術(shù)沉默凡納濱對(duì)蝦甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá), 可抑制動(dòng)物蛻皮、甚至死亡, 組織蛋白酶L表達(dá)也相應(yīng)降低[13]。KK-42能夠顯著上調(diào)肝胰腺血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)(圖3), 這可能與動(dòng)物取食增加、需氧量上升以及滲透壓調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn), 在低氧環(huán)境中該蛋白水平降低, 相應(yīng)地動(dòng)物取食減少, 生長(zhǎng)發(fā)育推遲[13]; 而在蛻皮前, 血藍(lán)蛋白合成增加, Cu2+和Zn2+濃度隨之增加, 導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)滲透壓升高, 隨后吸水膨脹, 促使蛻皮[16—18]。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶主要是分解食物中的淀粉,形成D-葡萄糖, 參與維持動(dòng)物正常的生理功能[19]。在對(duì)照組中, α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的表達(dá)量較高, 但變化幅度不大(圖4、圖5), 提示凡納濱對(duì)蝦幼蝦對(duì)淀粉類食物的利用相對(duì)穩(wěn)定。在KK42處理后, 二者表達(dá)均受到不同程度的抑制, 這可能是動(dòng)物加大了對(duì)蛋白質(zhì)的利用, 從而減少了淀粉的攝入以及D-葡萄糖的消耗。如前所述, 在同樣條件下, 胰蛋白酶、組織蛋白酶L和血藍(lán)蛋白表達(dá)增加, 進(jìn)一步反映了凡納濱對(duì)蝦幼蝦在生長(zhǎng)發(fā)育過程中對(duì)蛋白質(zhì)和糖類的利用是不平行的[20]。研究表明, 如果動(dòng)物對(duì)淀粉的分解過快, 會(huì)導(dǎo)致可溶性單糖水平過高, 可溶性單糖較之氨基酸更易于被動(dòng)物吸收, 不利于蛋白質(zhì)的利用和儲(chǔ)備[19]。

已經(jīng)證明, 昆蟲、甲殼動(dòng)物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)錄受蛻皮激素的調(diào)控[21—23]。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下, 我們發(fā)現(xiàn)在8d的實(shí)驗(yàn)期間, 凡納濱對(duì)蝦血淋巴20羥蛻皮酮滴度呈逐漸上升的趨勢(shì)(結(jié)果未示),與這兩種酶基因表達(dá)水平的變化不一致。蛻皮激素化學(xué)結(jié)構(gòu)形式多樣, 20羥蛻皮酮僅是其中的一種。我們推測(cè)不同動(dòng)物的幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可能以某種結(jié)構(gòu)的蛻皮激素為主。KK-42處理可提高20羥蛻皮酮滴度(結(jié)果未示), 與KK-42對(duì)幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶上調(diào)表達(dá)結(jié)果一致(圖6、圖7), 它們的上調(diào)表達(dá), 有助于動(dòng)物新表皮的合成, 為蛻皮提供物質(zhì)儲(chǔ)備, 與KK-42的促生長(zhǎng)作用相一致。

[1] Dall W, Hill B J, Rothlisberg P C, et al.Moulting and Growth [M].In: Blaxter J H S Southward A J (Eds.), The Biology of the Penaeidae.Advances in Marine Biology, 1990, 213—250

[2] Phlippen M K, Webster S G, Chung J S, et al.Ecdysis of decapod crustaceans is associated with a dramatic release of crustacean cardioactive peptide into the haemolymph [J].Journal of Expermental Zoology, 2000, 203: 521—536

[3] Cuzon G, Rosas C, Gaxiola G, et al.Utilization of Carbohydrates by Shrimp [M].In: Cruz-Suarez L E, Ricque-Marie D, Tapia-Salazar M A, et al.(Eds.), Avances en Nutricion Acuicola V.Memorias del V Simposium de Nutricion Acufcola.19—22 Noviembre, 2000.Merida, Yucatan.2000, 328—339

[4] Anger K.The Biology of Decapod Crustacean Larvae [M].Lisse: Swets & Zeitlinger.2001, 420

[5] Arturo S P, Fernando G C, Adriana M A, et al.Usage of energy reserves in crustaceans during starvation: Status and future directions [J].Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 36: 241—249

[6] Asano S.Anti-juvenile hormone activity of imidazole Compound (KK-42) and its diminution by metroprene in the 4thinstar silkworm Bombyx mori [J].Applied Entomology and Zoology, 1986, 21: 63—69

[7] Wu J M, Wu Z D, Xu J L, et al.The effect of trimolter inducer KK-42 on the endocrine system in the silkworm Bombyx mori [J].Acta Entomologica Sinica, 1991, 34: 278—283

[8] Hirai M, Kamimura M, Kikuchi K, et al.cDNA cloning and characterization of Bombyx mori juvenile hormone esterase: an inducible gene by the imidazole insect growth regulator KK-42 [J].Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32: 627—635

[9] Ning Q J, Fu S G, Xu X J, et al.A new and practical application of JH antagonist KK-42 to promoting growth of shrimp Penaeus schmitti [J].Aquaculture, 2007, 270, 422—426

[10] Kureshy N, Davis D A.Metabolic Requirements for Protein by Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei [M].In: Cruz-Suarez L E, Ricque-Marie, D, Tapia-Salazar M A, et al.(Eds.), Avances en Nutricion Acufcola V.Memorias del V Simposium de Nutricion Acuicola.19—22 Noviembre, 2000.Merida, Yucatan.2000, 18: 161—180

[11] Juan S H, Julio C M.Activity of trypsin from Litopenaeus vannamei [J].Aquaculture, 2009, 290: 190—195

[12] Klein B, Le Moullac G, Sellos D, et al.Molecular cloning and sequencing of trypsin cDNAs from Penaeus vannamei (Crustacea, Decapoda): use in assessing gene expression during the molt cycle [J].Biochemistry and Cell Biology, 1996, 28: 551—563

[13] Hui H L, Tobe S S, Chan S M, et al.Characterization of the putative farnesoic acid O-methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp, Litopenaeus vannamei: Evidence for its role in molting [J].Peptides, 2008, 29: 252—260

[14] Le B C, Van W A, Sellos D, et al.Cloning and expression of cathepsin L-like proteinases in the hepatopancreas of the shrimp Penaeus vannamei during the intermolt cycle [J].Journal of Comparative Physiology, 1996, 166: 310—318

[15] Sara L, Jun Z, Jing L, et al.RNA interference targeting cathepsin L and Z-like cysteine proteases of Onchocerca volvulus confirmed their essential function during L3 molting [J].Molecular & Biochemical Parasitology, 2004, 138: 165—170

[16] Hea J M.The effects of hypoxia on hemocyanin regulation in Cancer magister: Possible role of Hypoxia-Inducible Factor-1 [J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2010, 386: 77—85

[17] Engel D W, Brouwer M, Mercaldo A R, et al.Effects of molting and environmental factors on trace metal body-burdens and hemocyanin concentrations in the American lobster, Homarus americanus [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 1999, 124: 345—349

[18] Sang G K, Byung W J, Ha H K, et al.Hemocyanin-derived phenoloxidase activity with broad temperature stability extending into the cold environment in hemocytes of the hair crab.Erimacrus isenbeckii [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2011, 24: 1325—1341

[19] Gerard C, Gabriela G, Toma G, et al.Factorial effects of salinity, dietary carbohydrate and moult cycle on digestive carbohydrases and hexokinases in Litopenaeus vannamei [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2005, 140: 29—39

[20] Douglas S E, Mandla S, Gallant J W, et al.Molecular analysis of the amylase gene and its expression during development in the winter flounder Pleuronectes americanus [J].Aquaculture, 2000, 190: 247—260

[21] Enmin Z, Milton F.Patterns of N-acetyl-β-glucosaminidase isoenzymes in the epidermis and hepatopancreas and induction of N-acetyl-β-glucosaminidase activity by 20-hydroxyecdysone in the fiddler crab, Uca pugilator [J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2006, 339: 30—36

[22] Yan L M, Enmin Z.Impacts of molt-inhibiting organochlorine compounds on epidermal ecdysteroid signaling in the fiddler crab, Uca pugilator, in vitro [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2009, 150: 436—441

[23] Daizo K, Takushi F, Hidehiro F, et al.Effects of 20-hydroxyecdysone and KK-42 on chitinase and β-N-acetylglucosaminidase during the larval-pupal transformation of Bombyx mori [J].Insect Biochemistry, 1991, 21(3): 277—284

THE EFFECT OF KK-42 ON THE EXPRESSION OF NUTRITIONAL STORAGE-ASSOCIATED ENZYMES IN THE SHRIMP LITOPENAEUS VANNAMEI

XIA Xi-Chao1,2, YANG Hong1, NING Qian-Ji1, Lü Li1and Lü Yan-Jie1
(1.College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453002, China; 2.Basic Medical College, Nanyang Medical University, Nanyang 473061, China)

KK-42; 凡納濱對(duì)蝦; 物質(zhì)儲(chǔ)備相關(guān)酶; 基因表達(dá)

KK-42;Litopenaeus vannamei; Nutritional storage-associated enzymes; Gene expression

Q459

A

1000-3207(2013)02-0388-05

10.7541/2013.32

2011-09-22;

2012-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30940008); 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20094104110003); 河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(2009HASTIT022)資助

夏西超(1977—), 男, 河南南陽人; 博士; 主要從事甲殼動(dòng)物激素調(diào)控研究。E-mail: xiaxichao8336@163.388om

寧黔冀, Tel: 0373-3326340; E-mail: ningqianji1964@163.com