趙艷茹，齊曦明，尹福在，劉 波，周 鈺，劉 文

近年來研究表明，肥胖是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要危險因子之一，肥胖及其相關(guān)疾病的重要發(fā)病機制是慢性非特異性炎癥過程。在肥胖和糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)體脂(尤其是腹內(nèi)脂肪)含量與炎癥反應(yīng)因子的水平顯著相關(guān)。炎性因子、趨化因子、巨噬細胞是肥胖癥、脂肪炎癥的重要參與者[1]。趨化因子CXCL5 是上皮細胞來源的中性粒細胞活化肽，由致炎因子白介素(IL)-1β或腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激產(chǎn)生，與IL-8協(xié)同誘導(dǎo)中性粒細胞的黏附活性，參與多種疾病的發(fā)生[2]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測河北省秦皇島地區(qū)漢族人群趨化因子CXCL5基因啟動子-156G/C的多態(tài)性，探討其與T2DM肥胖的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年2—10月在我院內(nèi)分泌科住院的T2DM患者210例(T2DM組)，均為漢族人，均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷標準；其中男105例，女105例；平均年齡(54.1±12.4)歲；排除伴有急慢性感染性疾病、嚴重心腦血管病變、肝腎功能不全及嚴重糖尿病急性代謝并發(fā)癥者。另選取同期在我院體檢中心體檢的健康者171例(對照組)，其中男88例，女83例；平均年齡(52.6±11.5)歲。兩組受檢者性別(χ2=0.283，P>0.05)、年齡(t=1.175，P>0.05)間有可比性。

1.2 主要儀器及試劑 Mastercycler T-Gradinet型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀(德國Eppendorf公司)，PCR試劑為Promega公司產(chǎn)品。DYCZ-28A型電泳槽(北京市六一儀器廠)，恒溫孵育箱。人全血DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)，Taq-DNA聚合酶、NRUⅠ限制性內(nèi)切酶(Promega公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因型檢測 (1)DNA提?。撼槿∷惺軝z者空腹外周靜脈血2 ml，采用北京天根生化科技有限公司的非離心柱型DP319-01試劑盒，提取白細胞基因組DNA。(2)PCR擴增目的片段：引物序列均查基因庫并參考文獻[3]設(shè)計，上游引物：5′-CTCCTCCTGGCCACCCTCGC-3′，下游引物：5′-TCAAGCTTTGGGATGCTGGGGAA-3′(上海捷瑞生物工程有限公司合成)。5×PCR緩沖液15 μl，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)4.0 μl，上下游引物各4.0 μl，Taq酶 0.5 μl，DNA產(chǎn)物4.0 μl，加水至50 μl，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)后，72 ℃終末延伸10 min。(3)PCR產(chǎn)物的回收純化：擴增片段長度為114 bp，分離純化擴增產(chǎn)物，測序(上海捷瑞生物有限公司測序，采用反方向測序)并與Gene Bank中CXCL5基因比較。(4)回收產(chǎn)物的酶切：用NRUⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切體系為20 μl，含10×緩沖液2.0 μl，乙?；Ｑ迩宓鞍?.125 μl，PCR產(chǎn)物10.0 μl，NRUⅠ內(nèi)切酶0.5 μl，加滅菌去離子水混勻后于37 ℃孵育箱中酶切14～16 h。(5)基因型的確定：酶切產(chǎn)物經(jīng)15%聚丙烯酰胺電泳，溴乙錠染色30 min，紫外燈下確定基因型。

1.3.2 由經(jīng)過培訓(xùn)并認證合格的調(diào)查員應(yīng)用標準技術(shù)方法進行身高、體質(zhì)量測量，并計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。依據(jù)亞太地區(qū)2000年標準，BMI≥25 kg/m2為肥胖。然后依據(jù)是否存在肥胖，將T2DM組及對照組受檢者分成非肥胖T2DM組、肥胖T2DM組、非肥胖對照組、肥胖對照組，比較各組受檢者CXCL5基因啟動子-156位點基因型分布及等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果 CXCL5基因啟動子-156位點有3種基因型，G/G基因型可被酶切為95、19 bp 2個片段；G/C基因型可被酶切為114、95、19 bp 3個片段；C/C基因型不可被酶切，可見1條電泳帶為114 bp(見圖1)。

2.2 T2DM組和對照組CXCL5基因啟動子-156G/C位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

2.3 非肥胖對照組、肥胖對照組、非肥胖T2DM組、肥胖T2DM組受檢者CXCL5基因啟動子-156位點基因型分布及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中組間CXCL5基因啟動子-156位點基因型分布及等位基因頻率兩兩比較，如肥胖T2DM組與非肥胖T2DM組、非肥胖對照組比較，肥胖對照組與非肥胖對照組、非肥胖T2DM組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而肥胖T2DM組與肥胖對照組比較，非肥胖T2DM組與非肥胖對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

注：1、2、3分別為C/C基因型、G/G基因型、G/C基因型，4為PCR擴增產(chǎn)物，M為DNA Marker；19 bp片段未顯示

圖1 CXCL5基因啟動子-156G/C PCR產(chǎn)物NRUⅠ酶切后電泳結(jié)果

Figure1 Electrophoresis results of PCR production NRUⅠof CXCL5-156G/C after cleavage

表1 T2DM組和對照組CXCL5基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of CXCL5 polymorphism genotype and allele frequency in patients with type 2 diabetes mellitus and controls

組別例數(shù)基因型G/G G/C C/C等位基因G C對照組171106(61 99)60(35 09) 5(2 92) 272(79 53) 70(20 47) T2DM組210124(59 04)72(34 29)14(6 67)320(76 19)100(23 81)χ2值2 801 029P值>0 05>0 05

表2 各亞組受檢者CXCL5基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕

注：與非肥胖對照組比較，*P<0.05；與非肥胖糖尿病組比較，△P<0.05；與肥胖對照組比較，▲P<0.05

3 討論

肥胖和T2DM具有普遍的炎性反應(yīng)特征。Herder等[4]研究顯示即便在校正傳統(tǒng)危險因素的影響后，低度炎癥反應(yīng)與T2DM依然顯著相關(guān)，因此前者很可能與后者的發(fā)病機制有關(guān)。趨化因子作為肥胖者中白細胞浸潤脂肪組織時的炎性遞質(zhì)，可能對啟動和延續(xù)前炎癥狀態(tài)有重要作用，后者可促進T2DM和心血管疾病的發(fā)生。CXCL5/ENA-78即上皮細胞來源的中性粒細胞活化肽，是趨化因子超家族的CXC亞族成員，具有很強的粒細胞趨化作用，為具有促進血管新生作用ELR+類[5]，參與炎癥、腫瘤、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。Zineh等[6]研究證實CXCL5基因啟動子-156位點多態(tài)性會影響中性粒細胞活化態(tài)-78(ENA-78)功能，并指出-156位點攜帶C等位基因者其血漿CXCL5水平顯著升高，并直接影響白細胞產(chǎn)生CXCL5。因此，CXCL5基因啟動子-156G/C多態(tài)性影響基因的表達水平。

在血清CXCL5與肥胖及胰島素抵抗的研究中，循環(huán)中的CXCL5水平與體質(zhì)量相關(guān)，Chavey等[7]研究發(fā)現(xiàn)肥胖個體血清CXCL5水平明顯高于較瘦個體。肥胖婦女進食4周極低熱量飲食(800 kcal/d)后，隨著體質(zhì)量的下降其CXCL5水平下降。Ková?iková等[8]的報道與前者一致，而且還提示在飲食計劃維持體質(zhì)量階段后(約6個月)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)明顯降低。而在中國上海大規(guī)模中老年人群調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，男性和女性腰臀比及血總膽固醇水平隨血清CXCL5的四分位數(shù)值增高而增加，指出了血清CXCL5與脂代謝密切相關(guān)[9]。

本研究結(jié)果顯示，T2DM患者與健康者CXCL5基因啟動子-156位點基因型分布及等位基因頻率間無顯著差異，提示CXCL5酶切位點基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病無明顯遺傳關(guān)聯(lián)性，與近期國外報道[3]不一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)肥胖T2DM組CXCL5基因啟動子-156位點CC、CG、GG基因型構(gòu)成及等位基因頻率與非肥胖T2DM組、非肥胖對照組比較，肥胖對照組與非肥胖對照組、非肥胖T2DM組比較，均有顯著差異。提示肥胖T2DM患者C等位基因頻率顯著高于非肥胖健康者及非肥胖T2DM患者，肥胖健康者C等位基因頻率顯著高于非肥胖健康者及非肥胖T2DM患者；而肥胖T2DM患者與肥胖健康者比較，非肥胖T2DM患者與非肥胖健康者比較，基因型分布及等位基因頻率間均無顯著差異。表明肥胖者不論有無糖尿病，其C等位基因頻率均高于非肥胖者，提示CXCL5基因啟動子-156G/C位點多態(tài)性與肥胖密切相關(guān)，而與T2DM可能無關(guān)。該基因啟動子-156位點G-C變異有可能是引起肥胖的重要遺傳因素。這與Chavey等[7]結(jié)測CXCL5是肥胖及相關(guān)疾病起因的結(jié)論相一致。

總之，CXCL5基因啟動子-156G/C位點多態(tài)性有可能是引起肥胖的眾多基因或因素之一，與其他因素共同影響肥胖的發(fā)生。下一步研究方向是檢測CXCL5 mRNA的表達及血清、尿中CXCL5水平，并加大樣本量，開展多中心、多種族的研究。

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