朱立新，王 坤，曹延林，黃漢清，楊連軍

椎間盤退變在臨床上多表現(xiàn)為脊柱節(jié)段不穩(wěn)、椎管狹窄、頸椎病、腰腿痛、椎間盤突出等，是多種脊柱退行性疾病的病理基礎和前提，目前其發(fā)病機制尚不完全明確，凋亡髓核細胞、椎間盤內(nèi)蛋白多糖水平降低以及新生血管形成在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]。Zhang等[3]首先在突出的椎間盤組織中發(fā)現(xiàn)血管結(jié)構(gòu);Akeda等[4]研究發(fā)現(xiàn)，新生血管形成在椎間盤自發(fā)性吸收過程中起重要作用。環(huán)氧化酶2(COX-2)和缺氧誘導因子1α(HIF-1α)在新生血管形成過程中發(fā)揮著關鍵性的作用，且HIF-1α在人類椎間盤組織中表達[5]。COX-2和HIF-1α在誘導新生血管形成過程中密切相關[6]，體外研究證明，HIF-1α可誘導人內(nèi)皮細胞COX-2表達，而COX-2表達產(chǎn)物又進一步促進HIF-1α表達。Huang等[7]研究表明，COX-2/前列腺素E2(PGE2)/HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤血管生成過程中的重要通路。本研究通過建立椎間盤退變大鼠模型，探討不同類型COX-2抑制劑對椎間盤退變模型大鼠HIF-1α和VEGF表達的影響，旨在為椎間盤退變的治療提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組選擇12月齡SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(210±11)g，均購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。建立椎間盤退變模型后將大鼠放入單獨籠中進行飼養(yǎng)，采用簡單隨機法將大鼠分為4組，每組15只。對照組采用安慰劑10 mg·kg-1·d-1灌胃給藥；塞來昔布組采用塞來昔布膠囊(批號：BK110677，大連輝瑞制藥有限公司)10 mg·kg-1·d-1灌胃給藥；尼美舒利組采用尼美舒利顆粒(批號：110517，海南中瑞康芝制藥有限公司)10 mg·kg-1·d-1灌胃給藥；雙藥組采用塞來昔布膠囊5 mg·kg-1·d-1和尼美舒利顆粒5 mg·kg-1·d-1灌胃給藥；共飼喂8周。

1.2大鼠椎間盤退變模型建立方法各組大鼠采用6.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯臥位，固定四肢，腰背部備皮，消毒鋪單，沿腰背部棘突做后正中切口，切開皮膚后沿骨膜下剝離，咬骨鉗去除以L3為中心的L1～S1棘突、關節(jié)突和棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎棘肌，然后逐層縫合皮下筋膜、皮膚。

1.3觀察指標飼喂完成后處死所有大鼠，迅速取出每只大鼠的L2～3、L3～4、L4～5、L5～S1椎間盤。

1.3.1采用SP免疫組化方法檢測HIF-1α和VEGF表達情況HIF-1α的檢測采用L2～3椎間盤，VEGF采用L3～4椎間盤，分別固定，制成厚度為4 μm的病理切片；烤片，乙醇和二甲苯梯度脫蠟水化，抗原修復，滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑，滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加二抗，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素進行復染，烘片、封片。使用已知陽性切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。HIF-1α兔抗鼠單克隆抗體、兔抗鼠COX-2單克隆抗體均購自美國Epiomics公司。

每組大鼠選取5個高倍不重疊視野進行觀察，HIF-1α和VEGF均以胞質(zhì)、胞核黃染為陽性判斷標準。(1)無染色為0，弱染色(淺黃色)為1，中等染色(棕黃色)為2，強染色(黃褐色)為3；(2)陽性細胞計數(shù)<5%為0，5%～為1，25%～為2，>50%為3。(1)和(2)兩項結(jié)果相加等于0為陰性(-)，1～為弱陽性(+)，3～為陽性(++)，5～6為強陽性(+++)。

1.3.2蛋白多糖水平的檢測采用L4～5椎間盤，以吸光度值表示。檢測方法：將L4～5椎間盤組織研磨成勻漿，置入離心管中，加入3%氫氧化鈉溶液5 ml，恒溫振蕩器中振蕩3 h后加入鹽酸，調(diào)整溶液pH值為8～9，再加入胰蛋白酶酶解2 h。采用間苯三酚法進行蛋白多糖測定。

1.3.3軟骨細胞凋亡指數(shù)(AI)采用L5～S1椎間盤，脫鈣，制成厚度為4 μm的病理切片，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL法)計數(shù)椎間盤組織中凋亡細胞數(shù)目，每組計數(shù)10個400倍視野，計算平均100個細胞中含有的凋亡細胞數(shù)目即為AI。凋亡軟骨細胞表現(xiàn)為軟骨陷窩內(nèi)細胞核呈棕黃色或棕色，伴或不伴有核染色質(zhì)邊集或濃集、核碎裂、核固縮；非凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核藍染。

2　結(jié)果

2.1HIF-1α和VEGF陽性表達情況對照組大鼠HIF-1α和VEGF均呈陰性表達，其他各組均呈陽性表達，表現(xiàn)為胞質(zhì)、胞核黃染(見圖1)。各組大鼠HIF-1α、VEGF陽性表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2蛋白多糖水平及AI各組大鼠蛋白多糖水平、AI比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表1各組大鼠HIF-1α和VEGF陽性表達情況比較(只)

Table1Comparison of the positive expression of HIF-1α and VEGF in each group

組別只數(shù)HIF-1α - + +++++VEGF - + +++++對照組151500 0 15000塞來昔布組15 0 08 7 0 087尼美舒利組15 0 06 9 0 078雙藥組15 0 0511 0 069H值12.0012.20P值0.0470.045

注：HIF-1α=缺氧誘導因子1α，VEGF=血管內(nèi)皮生長因子；-表示陰性，+表示弱陽性，++表示陽性，+++表示強陽性

注：A：HIF-1α陽性表達表現(xiàn)為胞質(zhì)、胞核黃染；B：VEGF陽性表達表現(xiàn)為胞質(zhì)、胞核黃染

圖1　HIF-1α和VEGF陽性表達情況(SP免疫組化，×200)

3　討論

前列腺類物質(zhì)是機體炎癥反應的始動因子，其被花生四烯酸催化的限速酶是COX-2，而前列腺素類物質(zhì)引起的炎癥反應是椎間盤退變早期出現(xiàn)臨床癥狀的主要原因。研究表明，正常椎間盤組織中前列腺素物質(zhì)水平明顯低于突出椎間盤組織，并具有一定的規(guī)律性[8]。Roberts等[9]研究證實，前列腺素類物質(zhì)可抑制椎間盤組織細胞蛋白多糖的合成，而蛋白多糖水平降低是引起椎間盤發(fā)生退變的關鍵。COX-2可能通過調(diào)節(jié)前列腺素類物質(zhì)的生成而影響蛋白多糖水平，進而引起椎間盤發(fā)生退變。而且，COX-2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關，其可能的作用機制主要有以下幾個方面：(1)抑制內(nèi)皮細胞的凋亡；(2)PGE2等可直接誘導血管生成，促進內(nèi)皮細胞移位，前列腺素和COX-2在子宮內(nèi)膜異位癥的血管形成中起重要作用[10]；(3)增加促血管生成因子如VEGF等的表達，COX-2與VEGF在腫瘤血管形成中有協(xié)同效應[11]。曹飛麟等[12]研究表明，COX-2能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的凋亡；研究表明，COX-2是調(diào)節(jié)腫瘤新生血管形成，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡的重要手段[13]。

Ha等[5]通過免疫組化方法證實，突出椎間盤組織中的HIF-1α表達水平明顯高于正常椎間盤組織，且HIF-1α的表達與細胞凋亡存在相關性。Zeng等[14]通過在體外正常及缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)椎間盤髓核細胞，證實HIF-1α可通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3的表達而影響椎間盤髓核細胞的存活時間及凋亡，在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。由于腫瘤組織生長速度快，當其增生的速度超過周圍血管的生長速度時，就會使得局部組織嚴重缺氧，從而誘導HIF-1α的表達。激活的HIF-1α的作用有兩方面：一是作用于存在于血管內(nèi)皮細胞表面的VEGF受體，誘導血管生成增多；二是通過抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡，促進新生血管的生成[15]。

本研究結(jié)果顯示，各組大鼠HIF-1α和VEGF表達量間有顯著差異，以雙藥組抑制效果最為明顯。表明通過抑制COX-2可有效地抑制HIF-1α和VEGF的表達，可能在延緩椎間盤退變進程中起作用。各組大鼠蛋白多糖水平間有顯著差異，以雙藥組蛋白多糖水平最高，提示不同類型COX-2抑制劑均可以在一定程度上增加椎間盤組織蛋白多糖水平，以聯(lián)合應用塞來昔布和尼美舒利效果最明顯。各組大鼠AI間有顯著差異，以雙藥組AI最小。表明COX-2可調(diào)節(jié)新生血管形成過程中血管內(nèi)皮細胞的凋亡。另外，HIF-1α可激活P53基因，通過抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡使血管生成增多，從而促進新生血管的生成。

綜上所述，不同類型COX-2抑制劑塞來昔布和尼美舒利可抑制HIF-1α和VEGF的表達，增加椎間盤組織蛋白多糖水平，降低AI，聯(lián)合應用效果更明顯，可能在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。

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