彭兵鋒 凌志強(qiáng) 羅君 袁嘉敏 鄭志國(guó) 毛偉敏

mir-183在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

彭兵鋒 凌志強(qiáng) 羅君 袁嘉敏 鄭志國(guó) 毛偉敏

目的 探討原發(fā)性食管鱗癌（ESCC）組織中mir-183的表達(dá)及其與患者臨床病理特征、基因表達(dá)及預(yù)后之間的關(guān)系。方法 檢測(cè)83例ESCC組織及癌旁正常組織中mir-183以及基因的表達(dá)狀況，并對(duì)患者的臨床病理特征及預(yù)后進(jìn)行分析。結(jié)果 83例標(biāo)本中mir-183表達(dá)上調(diào)51例（61．4%），mir-183表達(dá)的上調(diào)與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）表達(dá)及不良預(yù)后有關(guān)（均P＜0．05）。結(jié)論 mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TopoⅡ的表達(dá)狀況有關(guān)，并提示預(yù)后不良。

mir-183 食管鱗癌 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ 預(yù)后

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前，對(duì)于食管癌的早期診斷及治療較以往已取得巨大進(jìn)步，但術(shù)后生存率仍不容樂(lè)觀，其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和探討[1]。近年來(lái)，關(guān)于microRNAs（miRNAs）的研究被廣泛關(guān)注，其在腫瘤中的作用機(jī)制也成為科研熱點(diǎn)。miRNAs是新近發(fā)現(xiàn)的一組天然豐富的小RNA，長(zhǎng)度約17～25個(gè)核苷酸，新近研究表明miRNAs屬于表觀遺傳學(xué)的范疇[2-3]。miRNAs在腫瘤的演變過(guò)程中的作用類與癌基因或抑癌基因相似[4-6]。mir-183是miRNAs家族的一員，有研究指出，mir-183的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7-8]。但是，有關(guān)mir-183的異常表達(dá)在原發(fā)性食管鱗癌（ESCC）的演變過(guò)程中的作用及其機(jī)制尚有待研究。在中國(guó)，食管癌的主要病理類型是ESCC，食管腺癌主要發(fā)生于西方國(guó)家[9]。本文通過(guò)檢測(cè)ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中mir-183的表達(dá)狀況，探討原發(fā)性ESCC患者組織中mir-183的表達(dá)狀況及其與食管癌臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2009-07—2010-09浙江省腫瘤醫(yī)院食管癌手術(shù)后組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常組織，患者術(shù)前均未接受化療或放療83例。其中男72例，女11例，年齡41～74歲（≥60歲36例，＜60歲47例）；高/中分化64例，低分化19例；上/中段病變35例，下段病變48例；Ⅰ/Ⅱ期34例，Ⅲ/Ⅳ期49例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm外區(qū)域，為肉眼下正常組織，上述組織切除后，快速用液氮冷凍并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中用作RNA提取。全部腫瘤組織均經(jīng)病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤分級(jí)、TNM分期分別按照2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)該83例患者術(shù)后進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截至2011-10-15。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 RNA提取試劑盒MiRNeasy Mini Kit購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司，瓊脂糖、0.5%TBE液、EB液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real time RT-PCR試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）購(gòu)于日本TaKaRa公司。引物由上海Invitrogen公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：mir-183：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，對(duì)照組U6：5′-CGCTTCGGCAGCACA TATAC-3′，下游通用引物由反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Ki（tD350A）提供。按照MiRNeasy Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取ESCC組織及其癌旁組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量，判定所取總RNA的濃度和純度，要求光密度值A(chǔ)260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液與1.5%的變性瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，測(cè)定所提RNA的完整性。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 取1μg總RNA使用PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，具體操作參照使用說(shuō)明。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 Real time RT-PCR的PCR擴(kuò)增及溶解曲線分析均使用ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems），采用20μl的反應(yīng)體系，具體操作參照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ的使用說(shuō)明。反應(yīng)過(guò)程具體為：50℃激活聚合酶2min，95℃預(yù)變性1min；95℃變性5s，60℃退火和延伸34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。結(jié)束后通過(guò)95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲線。應(yīng)用實(shí)時(shí)RTPCR方法及2-ΔΔCT法對(duì)檢測(cè)出的ESCC患者癌組織及癌旁正常組織中mir-183的表達(dá)狀況進(jìn)行分析（表達(dá)上調(diào)：ΔΔCT＜-1，表達(dá)下調(diào)：ΔΔCT＞1，正常表達(dá)：-1＜ΔΔCT＜1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同臨床病理特征和基因表達(dá)情況者之間的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，生存曲線用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線比較，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。

2 結(jié)果

2.1 mir-183在ESCC組織中的表達(dá) mir-183表達(dá)下調(diào)8例，表達(dá)正常24例，表達(dá)上調(diào)51例。

2.2 mir-183表達(dá)上調(diào)與ESCC的臨床病理特征及基因表達(dá)的關(guān)系 見(jiàn)表1、2。

由表1可見(jiàn)，mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、腫瘤浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。由表2可見(jiàn)，mir-183的表達(dá)上調(diào)與TopoⅡ的表達(dá)狀況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與p53、CerbB-2、MRP的表達(dá)狀況無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

表1 mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC的臨床病理特征的關(guān)系

表2 mir-183的表達(dá)上調(diào)與基因表達(dá)的關(guān)系

2.3 mir-183表達(dá)上調(diào)與患者預(yù)后的關(guān)系 在51例mir-183表達(dá)上調(diào)的ESCC患者中復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡總數(shù)為42例（82.4%），而32例非表達(dá)上調(diào)的ESCC患者中復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡總數(shù)為15（46.9%），提示mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC的不良預(yù)后相關(guān)（圖1）。Cox模型回歸多因素分析結(jié)果顯示，mir-183的表達(dá)上調(diào)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及ToPoⅡ的表達(dá)一起作為ESCC患者預(yù)后的影響因子（P＜0.05，表3）。

圖1 mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC患者在生存率的生存曲線

表3 mir-183的高表達(dá)與臨床病理特征的COX多因素分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用real time RT-PCR方法檢測(cè)了83例原發(fā)ESCC組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中mir-183的表達(dá)水平，并用2-ΔΔCT法測(cè)定83例ESCC組織及癌旁組織中mir-183的表達(dá)差異，結(jié)果說(shuō)明mir-183在癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織為高[10-13]。

在與臨床病理特征關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC標(biāo)本中mir-183的表達(dá)上調(diào)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說(shuō)明mir-183表達(dá)上調(diào)與ESCC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-14]，另外，在與基因的表達(dá)狀況的統(tǒng)計(jì)分析中發(fā)現(xiàn)，TopoⅡ陽(yáng)性的ESCC組織中mir-183的表達(dá)上調(diào)率也較TopoⅡ陰性為高。說(shuō)明mir-183表達(dá)上調(diào)與ESCC中TopoⅡ的表達(dá)相關(guān)[15-16]。在mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC患者預(yù)后的相關(guān)性方面，我們對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間進(jìn)行隨訪，并采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線比較，分析mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，到2011-10隨訪截止時(shí)，mir-183表達(dá)上調(diào)組的ESCC患者的病死率高于非表達(dá)上調(diào)組，mir-183表達(dá)上調(diào)組的ESCC患者的中位生存時(shí)間明顯比非表達(dá)上調(diào)組短。ESCC患者預(yù)后的Cox模型回歸多因素分析結(jié)果顯示，mir-183的表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TopoⅡ的表達(dá)一起作為ESCC患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。因此，本研究結(jié)果證實(shí)了mir-183的表達(dá)上調(diào)可能是ESCC患者的一個(gè)預(yù)后不良因子[8，13]。

總之，mir-183的表達(dá)上調(diào)在ESCC中是一個(gè)頻發(fā)事件，mir-183的表達(dá)上調(diào)與ESCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TopoⅡ表達(dá)相關(guān)，并提示不良預(yù)后。因此，mir-183可能是ESCC的預(yù)后因子之一。有關(guān)mir-183的表達(dá)上調(diào)與在ESCC中的作用機(jī)制的研究尚處于起步階段，mir-183在ESCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制還有待深入研究和探討，這將會(huì)為ESCC患者的預(yù)后評(píng)估提供更多理論指導(dǎo)。

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Expression of microRNA-183 in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with disease prognosis

Objective To investigate the expression of microRNA-183(mir-183)in esophageal squamous-cell carcinoma（ESCC）and its correlation with disease prognosis．MethodsThe expression of mir-183 was detected by real-time RT-PCR and immunohistochemistry in 83 ESCC tissue specimens and corresponding pericancerous tissues．ResultsAmong 83 ESCC samples mir-183 was significantly up-regulated(2～6411-fold)in 51 cases compared to the matching pericancerous tissues．Up-regulation of mir-183 expression was correlated with lymph node metastasis,expression of ToPoⅡand poor prognosis in ESCC patients(all P＜0．05)．ConclusionUp-regulation of mir-183 expression may indicate the poor prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma．

Mir-183 ESCC Lymph node metastasis TopoⅡ Prognosis

2011-12-15）

（本文編輯：楊麗）

衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目（WKJ2010-2-004）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2080749，Y2091110）；浙江省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（2009C33143）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科（彭兵鋒，系碩士研究生）；浙江省腫瘤醫(yī)院（凌志強(qiáng)、鄭志國(guó)、毛偉敏）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生部（羅君、袁嘉敏）

毛偉敏，E-mail：maowm1218@163.com