晏峰 孫倩 陳婧 林燕 杜兵 王曉歐 倪莉 胡云良

●論著

鈣通道基因CACNA1C基因多態(tài)性與腦卒中關系的研究

晏峰 孫倩 陳婧 林燕 杜兵 王曉歐 倪莉 胡云良

目的 探討鈣通道基因CACNA1C基因多態(tài)性與腦卒中的關系。方法檢測CACNA1C基因5個SNP位點rs10848683、rs2299661、rs1051375、rs216008、rs215976的基因型和等位基因頻率。結果腦梗死組與高血壓組CACNA1C rs2299661基因型CC頻率高于腦出血組和對照組（均P＜0．05）,腦梗死組與高血壓組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；腦梗死組C等位基因頻率高于腦出血組、高血壓組及對照組（均P＜0．05）；腦出血組、高血壓組及對照組間C等位基因頻率兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）。rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976各SNP位點基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）。結論CACNA1C的rs2299661 C/G多態(tài)性與中國人高血壓缺血性腦卒中的發(fā)生呈顯著相關，C等位基因可能為高血壓缺血性腦卒中的易感位點。

CACNA1C基因 腦卒中 腦出血 腦梗死 多態(tài)性

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship between CACNA1C polymorphism and stroke．MethodsTotal 795 hypertensive patients with stroke were enrolled in the study,including 377 cases of hemorrhagic stroke and 418 cases of ischemic stroke;413 cases of hypertension and 355 healthy subjects were also enrolled as controls．The mass spectrometry technology and direct CACNA1C gene sequencing technology were applied to test five SNP sites rs10848683,rs2299661,rs1051375, rs216008,rs215976,and the genotype and allele frequency were analyzed．ResultsThe frequencies of CACNA1C rs2299661 CC genotype in cerebral infarction and hypertension patients were higher than those in cerebral hemorrhage patients and normal controls(both P＜0．05),there was no significant difference between cerebral infarction and hypertension patients(P＞0．05)．The frequency of C allele in cerebral infarction patients was higher than that in cerebral hemorrhage,hypertension and control groups (all P＜0．05);there was no significant difference among cerebral hemorrhage,hypertension and control groups(all P＞0．05)．There were no significant differences in genotype frequencies and allele frequency of rs216008,rs1051375,rs10848683,rs215976 SNP locus among all groups(all P＞0．05)．ConclusionThe CACNA1C rs2299661 C/G polymorphisms is correlated with ischemic stroke in hypertensive patients,which indicates that C allele may be a susceptibility loci for hypertensive ischemic stroke．

腦卒中是一組以腦組織局部缺血和（或）出血引起腦組織損傷為主要臨床表現(xiàn)的疾病。有資料顯示我國腦卒中的發(fā)病率及病死率均高于世界平均水平[1]。據(jù)報道，我國原發(fā)性高血壓人群腦卒中的發(fā)生率較正常人群高5～30倍[2]，且高血壓病為腦卒中首要且獨立的危險因素[3]，提示兩者可能擁有共同的遺傳易感基因。其中L型鈣通道及其相關的多種病理生理現(xiàn)象與高血壓產(chǎn)生有密切聯(lián)系[4]，目前的研究認為鈣通道α1C亞基是形成L型鈣通道的中心孔蛋白[5]，L型鈣通道亞基基因CACNA1C的突變易導致鈣通道主要功能喪失[6]，這種功能喪失可能導致高血壓的發(fā)生[4]?；谡麄€CACNA1C基因序列測序的基礎上，我們選取可能有功能學意義的5個位點。這5個SNP來自于dbSNP庫，除去rs2299661位于內(nèi)含子以外，其余均位于外顯子。本研究在此基礎上擬探討鈣通道基因CACNA1C與高血壓性腦卒中的發(fā)病是否具有相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2010-03—2011-08就診的高血壓性腦卒中患者795例（其中溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院494例，溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院187例，鹿城區(qū)人民醫(yī)院114例）。男494例，女301例，年齡28～92（63.86± 11.21）歲。其中高血壓合并出血性腦卒中（腦出血組）377例，男243例，女134例，年齡28～92（61.43±11.33）歲；高血壓合并缺血性腦卒中（腦梗死組）418例，男250例，女168例，年齡34～90（65.82±11.40）歲。腦出血組、腦梗死組的選取分別符合2007年《中國腦血管病防治指南》診斷標準和《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》診斷標準。排除瓣膜性心臟病，心房顫動，血液病，腫瘤、腦血管藥物、腦血管畸形或動脈瘤等引起的繼發(fā)性腦卒中。在上述3家醫(yī)院同一時段另收集高血壓病患者（高血壓組）413例（溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院255例，溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院95例，鹿城區(qū)人民醫(yī)院63例），男274例，女139例，年齡36～88（62.52±9.42）歲。高血壓組符合2004年《中國高血壓防治指南》高血壓診斷標準（未治療前非同日3次測量，收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg者，或者血壓＜140/90mmHg，但正在服用降壓藥者）。（3）收集上述3家醫(yī)院同一時段健康體檢者355例作為對照組（溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院223例，溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院76例，鹿城區(qū)人民醫(yī)院56例），男219例，女136例，年齡46～88（61.78± 9.88）歲。納入標準：收縮壓＜140mmHg，舒張壓＜90mmHg，排除有心腦血管病或心腦血管病史者，有腦卒中家族史者。所有病例通過詢問病史、臨床生化相關指標，排除繼發(fā)性腦卒中、排除嚴重肝腎功功能不全和腫瘤疾病。同時問卷調(diào)查年齡、性別、吸煙史、飲酒史、測量身高、體重，并計算體重指數(shù)等臨床資料。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標的測量 采集研究對象空腹外周血5ml，其中2ml EDTA抗凝，于-70℃冰箱冷凍保存，準備抽提DNA。另留取靜脈血用于血脂[總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）]、脂蛋白（a）[LP（a）]、同型半胱氨酸（Hcy）、空腹血糖（FBG）等項目測定，研究用橫斷面病例-對照相關分析。

1.2.2 試驗方法步驟 （1）DNA的制備。采用細胞裂解和血紅素/蛋白沉淀技術,結合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法提取基因組DNA（AXYGEN公司）。（2）引物合成。全部引物（5對PCR擴增引物及5條延伸引物）均由由SEQUENOM公司的軟件Assay Design Design 3.1設計,北京擎科公司合成，見表1。（3）PCR擴增及SNP分型。利用多重PCR對目的序列進行擴增,通過多重PCR技術實現(xiàn)對所選的SNP位點的基因序列進行擴增。將上述擴增產(chǎn)物中加入ddNTP，并通過延伸引物（約20 bp）只能延伸一個堿基來實現(xiàn)SNP位點的擴增。延伸完畢后，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）基因分型技術，進行SNP分型。

表1 5個SNP位點的PCR引物及延伸引物

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。各組基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度采用χ2檢驗，各組基因型和等位基因頻率比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，計量資料用s表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 群體代表性檢驗 腦梗死組、腦出血組、高血壓組和對照組CACNA1C 5個SNP位點基因型分布，差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg平衡，表明此4組研究對象具有群體代表性。

2.2 CACNA1C基因多態(tài)性質(zhì)譜分析 見圖1-5（峰表示多態(tài)性位點，單峰表示純合子，雙峰表示雜合子）。

2.3 腦梗死組和腦出血組CACNA1C基因5個SNP位點基因型及等位基因分布頻率比較 見表2、3。

圖1 rs216008經(jīng)分型后得到3種基因型，依次為T/T、C/T和C/C型

圖2 rs215976經(jīng)分型后得到3種基因型，依次為C/C、C/T及T/T型

圖3 rs1051375分型得到3種基因型，依次為A/A型、G/A型及G/G型

圖4 rs2299661經(jīng)分型后得到3種基因型，依次為C/C、C/G及G/G型

圖5 rs1084683經(jīng)分型后得到3種基因型，依次為C/C、C/T及T/T型

由表2、3可見，腦梗死組、高血壓組CACNA1C rs2299661基因型CC頻率高于腦出血組和對照組（均P＜0.05），腦梗死組與高血壓組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；腦梗死組C等位基因頻率高于腦出血組、高血壓組及對照組（均P＜0.05）；腦出血組、高血壓組及對照組間C等位基因頻率兩兩比較，差異無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976各SNP位點基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表2 腦卒中各組、高血壓組和對照組CACNA1C各位點基因型分布頻率的比較[例（%）]

表3 腦卒中各組、高血壓組和對照組CACNA1C基因各SNP位點等位基因頻率比較[例（%）]

2.4 4組rs2299661 SNP與生化指標間的關系分析 見表4。

表4 四組不同rs2299661C/G不同基因型攜帶者生化指標比較

由表4可見，經(jīng)方差分析顯示rs2299661不同基因型之間的FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而LP（a）和Hcy水平差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較顯示CC型和CG型的LP（a）和Hcy明顯高于GG型者（均P＜0.01），但CC與CG型之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 腦梗死組患者rs2299661C/G不同基因型攜帶者生化指標比較 見表5。

表5 腦梗死組患者rs2299661C/G不同基因型攜帶者生化指標比較

由表5可見，對腦梗死組患者的rs2299661等位基因攜帶者（CC+CG基因型）與非攜帶者（GG純合子）的生化參數(shù)進行比較，結果也顯示LP（a）和Hcy水平兩組有明顯差異，C等位基因攜帶者的LP（a）和Hcy水平明顯高于非攜帶者（P＜0.05），而FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

腦卒中是遺傳易感性和環(huán)境因素共同決定的多基因遺傳性疾病，因此提倡尋找及并予積極干預腦卒中相關危險因素。已往對腦卒中遺傳致病基因主要集中在ACE基因、AGT基因、ApoE基因等的研究[2，7]，多數(shù)研究表明這些基因與腦卒中均存在相關性,但對這些基因在腦卒中的發(fā)病機制還不明,需更進一步的科學研究。目前已知的腦卒中危險因素中高血壓病為腦卒中首要且獨立的危險因素，且收縮壓每增加10mmHg，腦卒中發(fā)病相對危險增加49%；舒張壓每增加5mmHg，腦卒中危險增加46%[3]。提示兩者可能擁有共同的遺傳易感基因，故近年來有關腦卒中候選基因研究較多集中于與血壓調(diào)節(jié)和高血壓有關的基因。

電壓依賴性鈣通道L-VDCC[Ca（V）1]為鈣通道電壓依賴性鈣通道的一種類型，為調(diào)控鈣離子內(nèi)流的離子通道，是目前已知選擇性最強的離子通道[8]。研究認為L型鈣通道及其相關的多種病理生理現(xiàn)象與高血壓產(chǎn)生有密切聯(lián)系[4]，而研究證實L型鈣通道α1C亞單位是調(diào)節(jié)Ca2+進入細胞內(nèi)的主要通道，因此對人類編碼LTCCα1C亞基的基因CACNA1C研究[9]，對高血壓及腦卒中的防治有著重要的理論和臨床意義。

目前臨床應用最廣泛的降壓藥——鈣通道阻滯劑（CCB），其靶位點是位于細胞膜上的鈣通道α1C亞基[5]。但每一種特定的CCB都可能引起個體間降壓療效的差異，這可能是由于基因變異及各種非遺傳性因素等造成的不同患者的分子病理遺傳學機制不同[5-6]，因此推測α1C亞基基因（CACNA1C）的多態(tài)性可能會對CCB的療效產(chǎn)生影響。基于國外的研究，我們從dbSNP庫中選取了CACNA1C的5個 SNP（rs216008、rs1051375、rs2299661、rs10848683、rs215976），包括CACNA1C內(nèi)含子的61765C/G（rs2299661）、外顯子的 558674 C/T（rs216008）外顯子的628667 C/G（rs10848683）、外顯子的626417A/G（rs1051375）、外顯子的532175C/T（rs215976）。從結果顯示發(fā)現(xiàn)腦梗死組與高血壓組CACNA1C rs2299661基因型CC頻率高于腦出血組和對照組（P＜0.05），腦梗死組與高血壓組rs2299661基因型CC頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但等位基因頻率檢測呈現(xiàn)腦梗死組大于高血壓組現(xiàn)象，提示：（1）CACNA1C的rs2299661C/G多態(tài)性與中國人群缺血性腦卒中的發(fā)生有關聯(lián)；（2）腦梗死組與高血壓組兩者間可能存在著共同的遺傳易感基因。推測這種作用機制作為內(nèi)含子的rs2299661在腦梗死組中C/G可能產(chǎn)生基因變異，對鈣通道蛋白mRNA剪接產(chǎn)生影響：①出現(xiàn)原有的剪接位點消失，新的剪接位點生成；②編碼鈣通道氨基酸序列改變，這種改變可能引起鈣通道蛋白相關元件的變化，引發(fā)鈣通道通透性變化；③鈣離子內(nèi)流增加，肌細胞表面的動作電位改變，引起肌細胞的興奮收縮耦聯(lián)加強，外周血管阻力增加，出現(xiàn)腦血管的持續(xù)痙攣。另發(fā)現(xiàn)rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976 SNP位點腦梗死組、高血壓組與對照組組間的比較，未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），說明所選其它CACNA1C SNP位點與腦梗死間并無關聯(lián)性。

已有研究證實LP（a）是一種LDL樣脂蛋白，但由于尚含一高度糖基化和異質(zhì)性的載脂蛋白apo（a），使其有別于LDL-C。體外研究表明，LP（a）致病作用明顯強于LDL-C，可損傷內(nèi)皮功能[10]，刺激平滑肌增殖[11]。而平滑肌增殖為導致心腦血管疾病的病理基礎。Hcy是一含硫氨基酸,其水平升高與動脈粥樣硬化和血栓形成有關，而血栓形成為腦卒中的表現(xiàn)。本研究通過對4組rs2299661各基因型之間的生化指標進行比較發(fā)現(xiàn)，C等位基因攜帶者（CG和CC型）的LP（a）和Hcy水平明顯高于非攜帶者（GG純合子）（P＜0.01）；再進一步通過對腦卒中患者不同基因型的生化指標進行分析，同樣顯示C等位基因攜帶者的血LP（a）和Hcy水平明顯高于GG型者，提示CACNA1C rs2299661 C/G多態(tài)性可能參與LP（a）與Hcy高水平的表達。

腦卒中是多基因、多因素疾病,是遺傳和環(huán)境因素互相作用所致。全基因組關聯(lián)分析的實現(xiàn)，使得篩選出與腦卒中疾病相關的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）成為可能,準確、高通量的SNP分型技術建立的發(fā)展，將為復雜疾病易感基因的研究，找出其發(fā)病機制獲得可能[12]。

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Relationship between CACNA1C gene polymorphism and stroke

CACNA1Cgene Stroke Cerebral hemorrhage Ischemic stroke Polymorphism

2012-07-16）

（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學基金資助項目（LY12H09003）

323000 溫州醫(yī)學院附屬第六醫(yī)院（麗水市人民醫(yī)院）檢驗科（晏峰）；溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院（孫倩、陳婧、林燕、杜兵、王曉歐、倪莉、胡云良）

胡云良,E-mail：huyunliang66@163.com