曾生元， 龔紅兵， 李 闖， 林添資， 景德道， 盛生蘭

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所，江蘇 句容 212400)

稻飛虱是亞洲稻區(qū)的主要害蟲之一，對其防治主要依賴于高效化學殺蟲劑的使用，這對防治稻飛虱雖然起到了一定作用，但長期使用殺蟲劑導致飛虱的抗藥性增強、天敵減少、飛虱再猖獗，另外，化學藥劑的過度使用還會造成嚴重的環(huán)境污染。利用寄主抗性培育抗飛虱品種被認為是防治其危害最經濟、有效的途徑，因此，水稻育種家們努力尋找稻飛虱抗源，以期培育抗蟲品種。

近年來，水稻抗褐飛虱基因(主效基因)的發(fā)掘、定位及克隆工作取得了較大進展，目前已鑒定的抗褐飛虱基因超過30個［1］，多個抗褐飛虱基因已經被精細定位，其中Bph14及Bph18基因已成功克隆［2］;有8個有白背飛虱基因［3］及少數(shù)幾個抗灰飛虱基因［4］也已被定位。然而，目前鑒定的抗源大多數(shù)為野生稻和印度次大陸及東南亞的農家品種，其本身的綜合農藝性狀差，將有利抗性基因轉育到當前品種中所需周期較長;此外，從原始材料鑒定、定位及進一步精細定位一個抗飛虱基因所需周期也較長，例如對Bph14基因的克隆耗時14年［5］;而飛虱種群的生物型變異豐富，單個基因的抗性易隨飛虱生物型的變化而逐漸消失。因此，從推廣品種中尋找綜合抗性好的材料并將其中的抗性基因采用分子標記輔助選擇導入目標品種，結合田間抗性鑒定培育抗性品種具有重要的實踐價值。

此前的抗性鑒定初步表明，秈稻品種鎮(zhèn)秈232是高抗褐飛虱品種，其對白背飛虱及灰飛虱的發(fā)生也具有抑制作用，綜合性狀優(yōu)良［6］。為了探明鎮(zhèn)秈232對稻飛虱的抗性特性，我們對鎮(zhèn)秈232進行了稻飛虱抗性鑒定，構建鎮(zhèn)秈232/武育粳3號F2群體，檢測、分析其與褐飛虱抗性相關的基因位點，并采用分子標記輔助選擇改良鎮(zhèn)恢084的抗飛虱特性，以期為培育對飛虱具有綜合抗性的雜交稻提供材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗飛虱品種鎮(zhèn)秈232(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所培育)，對照IR36、IR26(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所保存)，鎮(zhèn)恢084(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所培育)，感蟲親本TN1(引自揚州大學)、武育粳3號(常規(guī)粳稻品種)。

1.2 抗蟲鑒定

供試材料抗飛虱特性鑒定采用徐紅星等［7］方法，略有改動。2010年5月上旬將上述材料浸種、催芽后，播種于5 m ×1 m的水泥池內，用200目紗網罩住，每處理2行，F(xiàn)2群體10行，每行播種50粒，行距5 cm，用感蟲品種武育粳3號播于試驗區(qū)周圍作保護行。待苗至二葉一心時，去除弱苗，定苗至每行30苗，按每苗5～7頭稻飛虱接蟲，重復3次。不施用任何對稻飛虱有影響的農藥，保護行多施1次氮肥，以誘發(fā)稻飛虱發(fā)生。接種后統(tǒng)計每苗上的稻飛虱數(shù)量與類型。

由于徐紅星等提出的抗性評價標準［7］較為粗放，在此基礎上參照劉光杰等標準［8］予以細化:當感蟲對照品種TN1死苗率達到95.0%時，根據(jù)死苗率評定抗性級別。評價標準為:死苗率≤1.0%，級別為 0，免疫;死苗率1.1% ～10.0%，級別為1，高抗;死苗率10.1% ～30.0%，級別為3，抗;死苗率 30.1% ～50.0%，級別為 5，中抗;死苗率50.1% ～70.0%，級別為7，中感;死苗率≥70.1%，級別為9，感。

1.3 分子標記檢測

根據(jù)系譜分析與田間抗性鑒定的結果，參照Sun等［9］研究結果，獲得與bph2緊密連鎖的標記，對鎮(zhèn)秈232的主效抗性基因進行檢測和分子標記輔助選擇。

1.4 DNA提取和PCR擴增、電泳檢測

參考McCouch等［10］的方法提取水稻苗期葉片的DNA。PCR反應體系(總體積20.0 μl):10×Buffer(含 MgCl2)2.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.2 μl，1 μmol/L正、反向引物各 0.3 μl，5 U/ μl Taq 酶 0.2 μl，100 ng/μl DNA 模 板 1.0 μl，ddH2O 15.0 μl。擴增反應程序:94℃下預變性3 min;94℃下變性30 s，55～60℃下退火40 s，72℃下延伸1 min，循環(huán)35次;最后72℃下再延伸5 min。擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測讀取結果后拍照或掃描保存。

2 結果

2.1 鎮(zhèn)秈232的抗飛虱特性

通過田間采集飛虱，3種飛虱(褐飛虱、灰飛虱、白背飛虱)分類飼養(yǎng)1至2代后分別以8頭/叢稻株接種，在接種后第10 d飛虱種群進入高峰期，部分稻株飛虱數(shù)量逾百頭，統(tǒng)計不同飛虱種群的數(shù)量發(fā)現(xiàn)褐飛虱占大多數(shù)，灰飛虱約占10.0%，白背飛虱占5.0%。表明，目前生產上前期主要還是褐飛虱危害，灰飛虱及白背飛虱危害較輕。

只含有Bph1基因的IR26中感褐飛虱，具有抗性基因bph2的IR36仍具有很高的抗性水平，鑒于2個基因對不同褐飛虱生物型的抗性特征，說明目前褐飛虱種群特性以生物型2為主，生物型1較少;鎮(zhèn)秈232比IR36的抗性水平略高，鎮(zhèn)恢084與IR26抗性相當，而武育粳3號高感飛虱。鎮(zhèn)秈232/武育粳3號F1表現(xiàn)為抗，F(xiàn)2抗性分離，接近1/3植株死亡。這些結果說明鎮(zhèn)秈232的抗飛虱特性受1對顯性主效基因控制，同時還具有一些微效的抗性基因。

2.2 鎮(zhèn)秈232的抗褐飛虱主效基因的來源及其驗證

分析鎮(zhèn)秈232的系譜可以發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)秈232的雙親為湘早燦3號(含IR36血統(tǒng))及IR54，因此鎮(zhèn)燦232可能攜帶了雙系的抗性主基因bph2，并且聚合了雙親的微效主基因。用IR36、鎮(zhèn)秈232、武育粳3號、TN1進行驗證，發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)秈232與IR36有一致的譜帶。綜合以上結果說明鎮(zhèn)秈232含有抗褐飛虱主效基因bph2。

2.3 鎮(zhèn)秈232的育種利用

2009年正季利用配合力好的優(yōu)良恢復系鎮(zhèn)恢084(含有Bph1基因)為母本，鎮(zhèn)秈232為父本雜交，2009冬在海南種植F1，并混收F2種子。2010年正季種植F2群體，根據(jù)田間綜合農藝性狀選擇37個優(yōu)良單株，提取選擇單株的DNA，利用標記RM463、RM7102進行檢測篩選，淘汰不含bph2基因的單株，保留含bph2基因(包括雜合型)的單株21個。2010年冬海南加代種植F3株系，根據(jù)田間綜合農藝性狀結合分子標記輔助選擇獲得7個含bph2基因單株，中選單株于2011年正季在句容種成F4小區(qū)，每個小區(qū)種植100株。苗期去除病苗，采用徐紅星等［7］方法田間鑒定當選群體的抗性水平。

結果顯示，雖然田間鑒定受到一定的環(huán)境影響導致抗性水平略有差異，在經過多代分子標記輔助選擇結合田間選擇之后，目標單株的抗飛虱特性仍能保留，說明采用bph2兩端的連鎖標記選擇有效，可大大減少重復鑒定的時間及精力。

3 討論

常規(guī)育種手段根據(jù)田間表型選擇后代，難以將多個有利的目標基因聚合到同一個體，并使這些基因在后代中穩(wěn)定傳遞、不丟失。在找到與抗病蟲基因緊密連鎖或共分離分子標記的基礎上，借助分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection)技術可有效地選擇抗蟲有利基因和QTL的聚合，排除環(huán)境因素的干擾，提高選擇的精確性，并可大大減少田間鑒定的工作量。之前在水稻抗病基因聚合育種研究方面已有很多報道:潘學彪等［11］通過分子標記輔助選擇將來自鎮(zhèn)稻88的抗條紋葉枯病基因Stv-bi導入優(yōu)質食味品種武育粳3號，選育出新的抗性品種武陵粳1號;Jiang等［12］聚合Xa21和Bt基因到恢復系明恢63中;倪大虎等［13］利用分子標記輔助選擇將廣譜高抗稻瘟病的Pi9基因和高抗白葉枯病的Xa21基因聚合到優(yōu)良品系中，獲得了含雙抗基因的一批優(yōu)良新品系。

迄今已精細定位了多個抗褐飛虱基因，少數(shù)基因已成功克隆，這些研究結果為水稻分子標記輔助選擇具有持久抗飛虱特性的品種提供了理論基礎和實踐支撐。然而，截止到目前，對水稻抗褐飛虱的分子育種大多處于理論研究階段［14-15］，對灰飛虱及白背飛虱的抗性育種研究尚處于空白階段。原因可能是由于稻飛虱種群較多，年份間差異較大，水稻抗飛虱鑒定易受環(huán)境和其他外界因素影響，無論是苗期、分蘗期、成熟期鑒定水稻的抗飛虱能力，都需要比較高的試驗條件，需要投入較多的人力、精力，而實際工作中往往較難滿足。另外，目前鑒定的抗源多數(shù)為野生稻或秈型原始材料，綜合農藝性狀、配合力較差，且單個基因的抗性效果不佳，應用價值不高。因此，直接從推廣品種中挖掘抗性水平高的資源，分析其抗性基因，再借助分子生物學手段將其中的抗性基因導入當前主栽品種，可以縮短育種年限，提高有利基因的利用效率。本研究發(fā)現(xiàn)水稻品種鎮(zhèn)秈232高抗褐飛虱，對白背飛虱也具有一定抗性，進一步通過系譜分析、抗性鑒定、分子標記檢測等發(fā)現(xiàn)該品種含有抗褐飛虱基因bph2。選擇含有抗褐飛虱基因Bph1的優(yōu)良恢復系鎮(zhèn)恢084為受體，通過1次雜交，將bph2導入鎮(zhèn)恢084，分子標記輔助選擇結合田間綜合農藝性狀的選擇，采用接近生產的抗性鑒定方法，在簡化操作的同時獲得了高抗稻飛虱的聚合材料，為改良雜交水稻的抗飛虱特性提供了有價值的中間材料。

致謝: 本試驗得到揚州大學農學院李榮德同學及揚州大學植物保護學院石兆鵬同學的無私幫助，再此深表感謝!

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