（復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

microRNA（miRNA或miR）是一類21～25nt大小的單鏈非編碼RNA，通過與mRNA的3′端非編碼序列互補(bǔ)結(jié)合而導(dǎo)致mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)人類約三分之一的蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖與凋亡、疾病的發(fā)生與發(fā)展等[1]。近年來與心血管疾病相關(guān)的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，本文擬從心臟組織和循環(huán)血液中的miRNA兩方面概述與心血管疾病相關(guān)的miRNA的研究現(xiàn)狀，并探討miRNA在心源性猝死法醫(yī)學(xué)鑒定中的可能應(yīng)用。

1 miRNA的生物學(xué)特性

miRNA首次由Lee等[2]于1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨后相關(guān)于miRNA的研究越來越多，目前發(fā)現(xiàn)miRNA既可在細(xì)胞內(nèi)存在，也可在細(xì)胞外的循環(huán)體液中存在[3-4]。細(xì)胞內(nèi)miRNA通常由pri-miRNA途徑合成：非編碼序列的基因轉(zhuǎn)錄形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha酶的剪切下變?yōu)?0 nt左右的莖環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)即pre-miRNA，此為miRNA的前體，但還不成熟，然后pre-miRNA經(jīng)核膜上的Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)入胞漿，在胞漿內(nèi)由Dicer酶切除莖環(huán)的環(huán)部結(jié)構(gòu)，形成21～25nt的雙鏈結(jié)構(gòu)，即 miRNA/miRNA*（miRNA* 為miRNA的互補(bǔ)鏈）。該雙鏈結(jié)構(gòu)中的miRNA再被高親和地選擇，與Dicer酶、Ago蛋白等組裝為miRNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（miRISC），miRNA*則被降解[5]。最近胞內(nèi)miRNA的mirtron合成途徑在哺乳動(dòng)物、果蠅和線蟲中被發(fā)現(xiàn)[6-8]，證實(shí)了miRNA還可由mirtron途徑合成，即內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄形成的非成熟mRNA部分經(jīng)剪接子剪接作用（區(qū)別于Drosha酶作用）形成了pre-mirtron，而后pre-mirtron經(jīng)Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)入胞漿，與pri-miRNA途徑類似，由Dicer酶剪切，最終形成miRISC[5]。

目前循環(huán)血液中的miRNA被廣泛檢測(cè)及篩選。循環(huán)miRNA可能系體細(xì)胞在負(fù)荷、損傷等刺激下由胞內(nèi)分泌至胞外。循環(huán)miRNA能在循環(huán)中逃避RNA的降解從而穩(wěn)定存在[9]，其機(jī)制可能是miRNA通過外體[10]、超微小泡[11]、凋亡小體[12]或者形成蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物[13]來實(shí)現(xiàn)?；诖?，循環(huán)miRNA的主要優(yōu)點(diǎn)有：（1）穩(wěn)定，不受環(huán)境影響；（2）有組織特異性；（3）易通過RT-PCR定量檢測(cè)。因此，循環(huán)miRNA具有成為心血管疾病生物學(xué)標(biāo)志的巨大潛能，可能為疾病診斷及預(yù)后提供參考。

2 miRNA與心血管疾病

未成熟的miRNA沒有生物學(xué)功能，需要在Dicer酶的作用下完成加工成熟過程。Zhao等[14]利用Chelex技術(shù)特異性地敲除胚胎小鼠心肌組織中的Dicer酶基因，結(jié)果導(dǎo)致小鼠胚胎出現(xiàn)心包膜水腫、心室心肌層停止發(fā)育等多種發(fā)育問題，胚胎很快發(fā)生心力衰竭而死亡，表明miRNA與心血管疾病有密切關(guān)系。

2.1 miRNA與心肌肥大、心力衰竭

心肌肥大、心力衰竭所涉及的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208 以 及 miRNA-195，而 miRNA-21、miRNA-34a、miRNA-150 等也有報(bào)道。其中抑制心肌肥大的有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-150等，促進(jìn)心肌肥大的有miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21、miRNA-34a 等。

Cheng等[15]研究表明，在病理性心肌肥大中miRNA-1、miRNA-133表達(dá)下調(diào)，提示可能是心肌肥大的普遍通路，并提出了miRNA-1可能的靶基因：Ras-GAP、Cdk9、Rheb 及纖維連接素（fibronectin）。 Carè等[16]研究認(rèn)為，miRNA-133的靶基因?yàn)镽ho-A、Cdc42以及Nelf-A/WHSC2。miRNA-1及miRNA-133的下調(diào)減少了對(duì)靶基因的抑制表達(dá)，從而引起心肌肥大。

miRNA-208是由α肌球蛋白重鏈（α-myosin heavy chain，α-MHC）基因的27位內(nèi)含子編碼產(chǎn)生，能在應(yīng)激時(shí)上調(diào)β-MHC的表達(dá)，抑制纖維化。Satoh等[17]比較了82例擴(kuò)張型心肌病和21例正常人的miRNA-208、miRNA-208a以及 miRNA-499后，發(fā)現(xiàn)miRNA-208與β-MHC的相關(guān)性很好，與擴(kuò)張型心肌病的關(guān)聯(lián)性大。van Rooij等[18]則不僅證實(shí)miRNA-208與心肌肥大相關(guān)，還首次提出甲狀腺相關(guān)的蛋白質(zhì)激素受體（THRAP1）是miRNA-208的作用靶點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)還在大鼠胸主動(dòng)脈狹窄心肌肥大模型中篩選了一系列表達(dá)上調(diào)的miRNA，并通過轉(zhuǎn)基因的方法過表達(dá)miRNA-195，發(fā)現(xiàn)miRNA-195足以引起心肌肥大和心力衰竭。不同的研究得出了不同的結(jié)論，提示miRNA與心肌肥大、心力衰竭存在關(guān)聯(lián)性。

2008年，Chen等[19]對(duì)中國(guó)人血清中所有miRNA進(jìn)行測(cè)序分析，提出血清miRNA是一種能夠應(yīng)用于檢測(cè)多種癌癥和其他疾病的潛在生物學(xué)指標(biāo)。Tijsen等[20]篩選并檢測(cè)了12位慢性心衰（chronic heart failure，CHF）患者和 12位正常人的血液miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA-423-5p在CHF中升高最明顯，并且與急性心肌梗死關(guān)系密切的miRNA-1、miRNA-208在CHF中并不升高，提示miRNA-423-5p在CHF中特異性較好。此外，Corsten等[21]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-499在急性心衰（acute heart failure，AHF）患者血液中升高明顯，而且肝特異性的miRNA-122也升高，推測(cè)為心力衰竭后肝靜脈淤血所致。提示miRNA-499與AHF可能有關(guān)系?？梢夾HF、CHF中可能分別和血液中某種miRNA存在密切關(guān)聯(lián)性。

2.2 miRNA與急性冠脈綜合征

Bostjancic等[22]研究了24例急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者，發(fā)現(xiàn)心臟梗死區(qū)的遠(yuǎn)端心肌miRNA-1高表達(dá)，此外Shi等[23]在小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)不同的miRNA在心梗后隨時(shí)間不同表達(dá)也各異。如心梗后第2天，miRNA-31、miRNA-223、miRNA-18a以及miRNA-18b表達(dá)上調(diào)，而第7天miRNA-31、miRNA-214、miRNA-199a-5p 以及 miRNA-199a-3p上調(diào)，提示某些miRNA可作為心梗后特定時(shí)間的特異性生物學(xué)指標(biāo)，同時(shí)也表明不同的miRNA與心梗后心肌后續(xù)損傷相關(guān)。Fazi等[24]和Sluijter等[25]研究分別發(fā)現(xiàn)miRNA-233、miRNA-499與炎癥相關(guān)，而Shi等[23]研究表明心梗后早期miRNA-233、miRNA-499表達(dá)改變，說明心梗后早期以組織炎癥損傷為主。

血液循環(huán)中的miRNA與急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）的關(guān)系一直是研究熱點(diǎn)。Ji等[26]發(fā)現(xiàn)大鼠血漿miRNA-208可以作為心肌損傷的重要標(biāo)志，不僅與cTnI線性關(guān)系很好，而且在其他部位表達(dá)量并不升高，提示miRNA-208具有很好的組織特異性。但Adachi等[27]在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miRNA-208并不具有心肌特異性，而miRNA-499在AMI患者中呈特異性表達(dá)。Corsten等[21]在研究32位AMI時(shí)發(fā)現(xiàn)miRNA-208b和miRNA-499顯著升高，和對(duì)照組相比分別升高1600倍和100倍。這些均提示miRNA-208a、miRNA-208b或miRNA-499可能作為人類AMI的生物學(xué)指標(biāo)。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)所有心?；颊咴诎l(fā)作4 h內(nèi)miRNA-208a都能檢測(cè)到（cTnI不能檢測(cè)出陽(yáng)性變化），支持miRNA-208a可作為心梗早期診斷指標(biāo)的觀點(diǎn)，Widera等[29]發(fā)現(xiàn)miRNA-133a或miRNA-208b可單獨(dú)用于ACS的預(yù)后診斷。

2.3 miRNA與急性肺動(dòng)脈栓塞

急性肺動(dòng)脈栓塞（acute pulmonary embolism，APE）發(fā)病急、死亡率高，而目前診斷主要依賴于D-二聚體的檢測(cè)和胸部CT平掃。D-二聚體檢測(cè)缺乏特異性，螺旋CT動(dòng)脈造影特異性雖然能達(dá)90%，但檢查費(fèi)用昂貴，且造影劑可能導(dǎo)致過敏、腎衰等副反應(yīng)，因此尋找一種特異性高又適合推廣的生物學(xué)指標(biāo)很有必要。Xiao等[30]選取了32例APE病例、32位正常人以及22位非APE患者的血漿進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-134僅在APE患者血漿中高表達(dá)，特異性非常高，因此可能是APE的有效生物學(xué)指標(biāo)。

2.4 miRNA與心律失常

Yang等[31]研究發(fā)現(xiàn)正常小鼠注射miRNA-1后出現(xiàn)心律失常，注射miRNA-1阻斷劑后心律失常發(fā)生率明顯降低，提示miRNA-1與心律失常關(guān)系密切，進(jìn)一步研究顯示miRNA-1作用的靶基因分別為KCN2和GJA1。其中KCN2為編碼細(xì)胞膜K+通道蛋白主要亞基，GJA1編碼心肌縫隙連接蛋白43（connexin 43，CX43），因此 miRNA-1 通過抑制 K+通道蛋白和CX43的基因表達(dá)，從而干擾靜息膜電位并阻止心肌細(xì)胞間信號(hào)傳遞，最終導(dǎo)致心律失常，這與Bostjancic 等[22]的研究結(jié)果一致。此外，Bostjancic 等[22]發(fā)現(xiàn)心律失常的樣本中miRNA-133表達(dá)下調(diào)，這與Luo等[32]研究發(fā)現(xiàn)的miRNA-133抑制起搏點(diǎn)通道基因HCN2表達(dá)結(jié)論一致。miRNA-133下調(diào)，則HCN2表達(dá)上升，因而導(dǎo)致心律失常。由此可見，miRNA-1表達(dá)上調(diào)，miRNA-133表達(dá)下調(diào)可能分別導(dǎo)致靶基因的表達(dá)異常，從而導(dǎo)致心律失常，這為心律失常的診斷和治療提供了新的思路。

3 miRNA的法醫(yī)學(xué)意義

miRNA在生物體內(nèi)廣泛存在，大量研究報(bào)道了miRNA對(duì)心血管疾病的作用，包括心肌肥大、心力衰竭、急性心肌梗死、急性肺動(dòng)脈栓塞、心律失常等。心肌組織中一種或幾種miRNA表達(dá)改變可能為某種心血管疾病的特異性指標(biāo)，因此有望為心源性猝死的死因分析提供新思路。如miRNA-1表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是心梗后誘發(fā)心肌重構(gòu)和心律失常的重要因子[31，33]，猝死者檢測(cè)到miRNA-1表達(dá)上調(diào)則提示死因?yàn)樾墓：笳T發(fā)的心律失常。miRNA主要由細(xì)胞內(nèi)mirtron途徑和經(jīng)典pri-miRNA途徑產(chǎn)生，當(dāng)物理、化學(xué)等因素導(dǎo)致細(xì)胞受損時(shí)，miRNA也會(huì)從胞內(nèi)進(jìn)入胞外的體循環(huán)中。循環(huán)血液中的miRNA能通過多種機(jī)制逃避循環(huán)中RNA酶的降解作用，因此能穩(wěn)定存在，不受環(huán)境影響，從而具有成為疾病診斷及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)的潛能。

與人類心血管疾病相關(guān)的miRNA較多，有些miRNA與多種疾病相關(guān)，如miRNA-1既與心肌肥大[15]有關(guān)，也與心律失常[22，31]、心肌梗死[22]相關(guān)；一種疾病可能涉及多種miRNA，如急性冠脈綜合征病發(fā)后有17種miRNA表達(dá)改變[23]，這些miRNA可能通過不同的靶基因而單獨(dú)影響蛋白表達(dá)，也可能在蛋白合成的同一條途徑不同環(huán)節(jié)進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)。相信隨著越來越多關(guān)于miRNA如何影響心血管疾病的深入研究，人類一定能找到某些心血管疾病特異性的miRNA，作為這些疾病診療及預(yù)后的新指標(biāo)，并為心源性猝死死亡機(jī)制分析提供新思路。

[1]Long D，Lee R，Williams P，et al.Potent effect of target structure on microRNA function[J].Nat Struct Mol Biol，2007，14（4）：287-294.

[2]Lee RC， Feinbaum RL， Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75（5）：843-854.

[3]Chim SS， Shing TK， Hung EC，et al.Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma[J].Clin Chem，2008，54（3）：482-490.

[4]Gilad S， Meiri E，Yogev Y，et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One，2008，3（9）：e3148.

[5]Zhu H，F(xiàn)an GC.Extracellular/circulating microRNAs and their potential role in cardiovascular disease[J].Am J Cardiovasc Dis，2011，1（2）：138-149.

[6]Berezikov E， Chung WJ， Willis J， et al.Mammalian mirtron genes[J].Mol Cell，2007，28（2）：328-336.

[7]Okamura K，Hagen JW，Duan H，et al.The mirtron pathway generates microRNA-class regulatory RNAs in Drosophila[J].Cell，2007，130（1）：89-100.

[8]Ruby JG，Jan CH，Bartel DP.Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing[J].Nature，2007，448（7149）：83-86.

[9]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（30）：10513-10518.

[10]Pegtel DM，Cosmopoulos K，Thorley-Lawson DA，et al.Functional delivery of viral miRNAs via exosomes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（14）：6328-6333.

[11]Akao Y，Iio A，Itoh T，et al.Microvesicle-mediated RNA molecule delivery system using monocytes/macrophages[J].Mol Ther，2011，19（2）：395-399.

[12]Zernecke A，Bidzhekov K，Noels H，et al.Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection[J].Sci Signal，2009，2（100）：ra81.

[13]Wang K，Zhang S，Weber J，et al.Export of microRNAs and microRNA-protective protein by mammalian cells[J].Nucleic Acids Res，2010，38（20）：7248-7259.

[14]Zhao Y， Samal E， Srivastava D.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J].Nature，2005，436（7048）：214-220.

[15]Cheng Y，Ji R，Yue J，et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart：do they play a role in cardiac hypertrophy?[J].Am J Pathol，2007，170（6）：1831-1840.

[16]Carè A， Catalucci D， Felicetti F， et al.MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy[J].Nat Med，2007，13（5）：613-618.

[17]Satoh M，Minami Y，Takahashi Y，et al.Expression of microRNA-208 is associated with adverse clinical outcomes in human dilated cardiomyopathy[J].J Card Fail，2010，16（5）：404-410.

[18]van Rooij E， Sutherland LB， Liu N， et al.A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 （48）：18255-18260.

[19]Chen X， Ba Y， Ma L， et al.Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res，2008，18（10）：997-1006.

[20]Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al.MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure[J].Circ Res，2010，106（6）：1035-1039.

[21]Corsten MF， Dennert R， Jochems S， et al.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease[J].Circ Cardiovasc Genet，2010，3（6）：499-506.

[22]Bostjancic E，Zidar N，Stajner D，et al.MicroRNA miR-1 is up-regulated in remote myocardium in patients with myocardial infarction[J].Folia Biol（Praha），2010，56（1）：27-31.

[23]Shi B， Guo Y， Wang J， et al.Altered expression of microRNAs in the myocardium of rats with acute myocardial infarction[J].BMC Cardiovasc Disord，2010，10：11.

[24]Fazi F， Rosa A， Fatica A， et al.A minicircuitry comprised of microRNA-223 and transcription factors NFI-A and C/EBPalpha regulates human granulopoiesis[J].Cell，2005，123（5）：819-831.

[25]Sluijter JP，van Mil A，van Vliet P，et al.MicroRNA-1 and-499 regulate differentiation and proliferation in human-derived cardiomyocyte progenitor cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（4）：859-868.

[26]Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury[J].Clin Chem，2009，55（11）：1944-1949.

[27]Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction[J].Clin Chem，2010，56（7）：1183-1185.

[28]Wang GK， Zhu JQ， Zhang JT， et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[J].Eur Heart J，2010，31（6）：659-666.

[29]Widera C，Gupta SK，Lorenzen JM，et al.Diagnostic and prognostic impact of six circulating microRNAs in acute coronary syndrome[J].J Mol Cell Cardiol，2011，51（5）：872-875.

[30]Xiao J， Jing ZC， Ellinor PT， et al.MicroRNA-134 as a potential plasma biomarker for the diagnosis of acute pulmonary embolism[J].J Transl Med，2011，9：159.

[31]Yang B， Lin H， Xiao J， et al.The muscle-specific microRNA miR-1regulatescardiacarrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2[J].Nat Med，2007，13（4）：486-491.

[32]Luo X， Lin H， Pan Z， et al.Down-regulation of miR-1/miR-133 contributes to re-expression of pacemaker channel genes HCN2 and HCN4 in hypertrophic heart[J].J Biol Chem，2008，283（29）：20045-20052.

[33]Anderson ME，Mohler PJ.MicroRNA may have macro effect on sudden death[J].Nat Med，2007，13（4）：410-411.